一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列及其重组全长抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还公开了一种抗吡唑醚菌酯重组全长抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术又公开了一种抗体表达质粒。将本发明专利技术得到的序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组全长抗体，与鼠源亲本抗体的识别活性一致，并使得抗吡唑醚菌酯抗体可大批量稳定生产，为吡唑醚菌酯残留检测的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列及其重组全长抗体
本专利技术属于基因工程
，尤其是涉及一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列及其重组全长抗体的制备与应用。
技术介绍
吡唑醚菌酯是一种由德国巴斯夫公司(BASF)在1993年开发的新型嗜球果伞菌素杀菌剂，它通过防止细胞色素B和C1之间的电子转移、抑制线粒体呼吸作用并抑制ATP的产生，最终导致致病性真菌无法进行正常的生理代谢而死亡。吡唑醚菌酯作为一种环保型杀菌剂，对非目标生物危害较小，但有报道发现其对蚕、斑马鱼存在一定的线粒体毒性和神经毒性，因此在农业生产中应控制吡唑醚菌酯的使用。根据最新的国家标准(GB2763-2019)，吡唑醚菌酯在谷物中的最大残留限量为0.2-1.0mg/kg，油料作物的最大残留限量为0.05-0.4mg/kg，蔬菜的最大残留限量为0.02-20mg/kg，水果中为0.05-4mg/kg，茶叶中为10mg/kg，其他类别为0.02-5mg/kg。目前，对吡唑醚菌酯残留的检测主要使用大型精密仪器如液相色谱、气相色谱-质谱联用、超高效液相色谱-质谱联用等方式；然而，这些仪器价格昂贵、样品准备过程复杂并且需要专业人员操作，因此很有必要研发一种快速、便捷、能够现场筛查吡唑醚菌酯残留的检测技术。自上世纪末，基于抗原-抗体反应的免疫分析方法被广泛应用，该方法的核心为高灵敏度高亲和性的抗体。第一代抗体为多克隆抗体，虽然制备方式简单，但抗体特异性相对较差。第二代抗体为基于杂交瘤细胞融合技术获得的高灵敏度和高亲和性的单克隆抗体。2008年，JOSEPV.MERCADER等人获得了一种抗吡唑醚菌酯的高亲和力单克隆抗体，并开发了酶联免疫吸附测定方法(ELISA)用于吡唑醚菌酯的检测，其检出限(LOD)低于0.1μg/L(Mercader,J.V.,Suárez-Pantaleón,C.,Agulló,C.,Abad-Somovilla,A.,&Abad-Fuentes,A..ProductionandCharacterizationofMonoclonalAntibodiesSpecifictotheStrobilurinPesticidePyraclostrobin[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry.2008,56(17):7682-7690.)；2011年，他们合成了多种位点异源半抗原，以筛选出亲和力更高的吡唑醚菌酯特异性单克隆抗体(Mercader,J.V.,Agulló,C.,Abad-Somovilla,A.,&Abad-Fuentes,A..Synthesisofsite-heterologoushaptensforhigh-affinityanti-pyraclostrobinantibodygeneration[J].Organic&BiomolecularChemistry.2011,9(5):1443.)；2013年，他们将ELISA与QuEChERS预处理方法相结合，用于分析六种水果中吡唑醚菌酯的残留(Mercader,J.V.,Agulló,C.,Esteve-Turrillas,F.A.,Abad-Somovilla,A.,&Abad-Fuentes,A..ImmunoassaysforpyraclostrobinanalysisinprocessedfoodproductsusingnovelmonoclonalantibodiesandQuEChERS-basedextracts[J].FoodControl.2013,32(1):42-48.)。但是，杂交瘤细胞存在基因背景复杂及长期传代和复苏冻存过程出现的基因缺失/突变现象，易导致不同批次间获得的单克隆抗体特异性识别抗原的能力有差异，影响免疫快检测方法的稳定性。第三代抗体，即重组抗体的出现可以有效提高抗体识别特异性和灵敏度的稳定性；研究者可根据单克隆抗体的基因序列构建重组表达质粒并利用哺乳动物工程细胞如HEK293(F)进行重组全长抗体的表达，获得的重组全长抗体具有与亲本单克隆抗体一致的识别灵敏度，在抗体基因序列已知的情况下可以不断获得稳定的重组抗体，建立更加稳定可靠的免疫快速检测方法。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种灵敏度高、特异性强的抗吡唑醚菌酯重组全长抗体的制备方法和稳定生产，以及该抗体的应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。作为优选，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。作为优选，轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。作为优选，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还公开了一种抗吡唑醚菌酯重组全长抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQIDNO:2所示。作为优选，所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术又公开了一种抗体表达质粒，含有上述任一项所述的重链可变区和小鼠重链IgG1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗吡唑醚菌酯重组全长抗体的重链蛋白；或者，含有如权利要求3-4中任一项所述的轻链可变区和小鼠轻链Kappa恒定区的核苷酸序列，可以表达抗吡唑醚菌酯重组全长抗体的轻链蛋白。本专利技术将一株能稳定分泌抗吡唑醚菌酯高特异、高灵敏单抗的杂交瘤细胞株的重链和轻链可变区基因成功扩增出来、测序和合成，采用同源重组技术分别构建了重链和轻链表达载体，并共转染至哺乳动物细胞HEK293(F)中，最终获得抗吡唑醚菌酯的重组全长抗体。经ELISA技术验证，该重组全长抗体与传统的抗吡唑醚菌酯天然小鼠腹水单抗相比，有一致的高灵敏度和高选择性，可以代替腹水单抗，应用于吡唑醚菌酯残留的免疫快速检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术公开的抗吡唑醚菌酯重组全长抗体的重链可变区、轻链可变区序列来源于经多次免疫小鼠、细胞融合及筛选得到的一株高特异性的抗吡唑醚菌酯的单克隆细胞株。将此序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组全长抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗吡唑醚菌酯抗体可大批量稳定生产，为吡唑醚菌酯残留检测的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。附图说明图1为本专利技术以反转录获得的cDNA为模板，吡唑醚菌酯抗体重链可变区基因、轻链可变区基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果。图2为本专利技术SDS-PAGE验证全长抗体在哺乳动物细胞HEK293(F)中的表达。图3为本专利技术抗吡唑醚菌酯重组全长抗体和小鼠腹水单抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。


2.根据权利要求1所述的特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.根据权利要求1或2所述的特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。


4.根据权利要求3所述的特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。


5.一种抗吡唑醚菌酯重组全长抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQIDNO:2所示。...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭逸蓉，柳颖，赵颖，焦沙沙，常云云，陆昕颖，朱国念，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33