一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列及其重组完整抗体的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还公开了一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。将本发明专利技术得到的序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组完整抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体可大批量稳定生产，为同步检测噻虫胺和呋虫胺的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列及其重组完整抗体的制备
本专利技术属于基因工程
，尤其是涉及一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体的制备和应用。
技术介绍
噻虫胺是一种第二代新烟碱类杀虫剂，因具有一个噻唑环基，其性能与传统烟碱类杀虫剂相比更为优异，作为一种高效广谱的新烟碱类杀虫剂，在过去几年一直是世界性的大型杀虫剂品种，其使用量和销售每年都保持在很高的水平，噻虫胺对非靶标生物毒性以及对生态环境的安全性影响的研究引起了人们的广泛关注。近两年来，全球多个国家推出限制噻虫胺使用的政策，欧盟现已禁止噻虫胺在室外环境下使用。在欧盟标准中，不同的食品中噻虫胺的最大残留限量(MRLs)为0.01-1.5mg/kg，在中国，噻虫胺的MRLs设定为0.02-2mg/kg。呋虫胺作为第三代新烟碱类杀虫剂，与其他常见新烟碱类杀虫剂的化学结构区别较大，以四氢呋喃基取代了以前的氯代吡啶基、氯代噻唑基，且不含卤族元素。同时，在性能方面也有所不同，杀虫谱更广、药效持久、对传统新烟碱类药剂已经产生抗性的害虫，防治效果更好。鉴于有些国家和地区对多种新烟碱类农药如吡虫啉、噻虫嗪、噻虫胺、噻虫啉等农药品种实施了禁限用政策，呋虫胺日渐成为多种新烟碱类农药杀虫剂的主要代替品，在欧盟标准中，不同的食品中呋虫胺的最大残留限量(MRLs)为0.02-8mg/kg，在中国，呋虫胺的MRLs设定为0.02-7mg/kg。为防止消费者和有益生物受到噻虫胺和呋虫胺残留的危害以及潜在影响，对环境和农产品中的噻虫胺和呋虫胺的监测具有重要的意义。目前，针对噻虫胺和呋虫胺的检测方法主要有仪器分析方法和免疫分析的检测方法。仪器分析方法如高效液相色谱、超高效液相色谱-串联质谱等，虽然这些方法灵敏可靠，但需要精密仪器、专业人员、高成本和复杂的制备步骤，因此无法实现大规模的快速现场分析。而基于抗原抗体反应的免疫分析检测方法无需专业的仪器和操作人员即可实现农药残留的快速检测，特别适用于农药残留现场大规模快速筛选和检测，可作为仪器分析方法的辅助或代替的方法，在农药残留分析中应用前景广阔。抗体是免疫分析方法中的关键反应元件，其质量的好坏直接影响了免疫分析方法的建立。从现有报道来看，国内外农药抗体的研究仍主要集中在传统抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体以及重组片段抗体，其在免疫分析上的应用上具有一定的局限性。如多克隆抗体存在免疫动物处死放血后，需要重新免疫，且抗体的均一性较差等问题；单克隆抗体的制备需要长期依赖杂交瘤细胞，若杂交瘤细胞发生抗体基因突变或细胞株丢失，则需重新研制、周期较长。随着基因工程技术的发展，第三代重组抗体的产生使得抗体的制备摆脱了对动物的依赖，确保不同批次制备的同一抗体具有高度的稳定性和一致性。另一方面，在获得抗体可变区基因序列的基础上，可实现抗体“永生”的目的。尽管针对农药的重组抗体研究早已报道，但多数是基于重组片段抗体单链抗体、抗原结合片段Fab等研究，其在生物活性等方面不能完全媲美于传统抗体，如重组片段抗体因其分子结构不同于天然抗体的“Y”型结构会出现不利于与胶体金、量子点等标记物偶联形成具有稳定识别活性的免疫探针等现象。因此，亟需开发具有可重现生产、稳定推广的新型重组抗体，这对于农药残留免疫速测技术及其的产品的开发与应用具有重要意义。基于哺乳动物细胞表达的重组完整抗体是以杂交瘤细胞、外周血淋巴细胞或动物脾细胞等中抗体重链和轻链基因序列为材料，通过基因工程技术制备的一种具有完整抗体结构的重组抗体，包括了重链可变区及其恒定区氨基酸序列和轻链可变区及其恒定区氨基酸序列，且抗体能够正确折叠和修饰，其抗体的生物活性接近天然抗体。由于抗体的恒定区基因较为保守，同一种属的同一类别的抗体恒定区序列基本恒定的，且序列是已知公开的，因此在构建重组完整抗体时，只需准确扩增出抗体可变区基因，利用分子克隆技术将可变区基因和恒定区基因拼接在一起，即可获得抗体的完整基因序列。与重组片段抗体相比，重组完整抗体的优势在于，结构与天然抗体最接近，可同时结合两个相邻的抗原表位或分子，与靶分子有高特异性和高亲和力，因此可以考虑代替传统亲本抗体的应用。目前已报道的重组完整抗体，多为人源抗体，应用于医疗领域，针对农药等小分子污染物的重组完整抗体还鲜有报道。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种具有可复制性、可稳定推广的、高灵敏的、可同时识别农药小分子噻虫胺和呋虫胺的宽谱重组完整抗体稳定生产和制备方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。作为优选，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。作为优选，轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。作为优选，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还公开了一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQIDNO:2所示。作为优选，所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术又公开了一种抗体表达质粒，含有上述任一项所述的重链可变区和小鼠重链IgG1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体的重链蛋白；或者，含有如权利要求3-4中任一项所述的轻链可变区和小鼠轻链Kappa恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体的轻链蛋白。本专利技术从一株能稳定分泌同时识别噻虫胺和呋虫胺的高灵敏单克隆抗体的杂交瘤细胞株出发，利用5’RACE技术扩增出其抗体重链和轻链可变区基因成功，借助同源重组技术分别构建了重链和轻链表达载体，利用脂质体介导共转染至HEK293F细胞中，通过哺乳动物细胞瞬时表达体系，制备出能同时识别噻虫胺和呋虫胺的重组完整抗体。经ELISA和SPR验证，该重组完整抗体对噻虫胺和呋虫胺有较高的灵敏度和亲和力以及对其他结构类似物无明显交叉反应，可应用于同时检测噻虫胺和呋虫胺两种新烟碱类农药免疫分析方法的建立。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：首先，本专利技术率先研制了一种可同时识别噻虫胺和呋虫胺的重组完整抗体，其抗体性能和亲本单克隆抗体相同。不同于亲本腹水单克隆抗体，其制备不需要依赖将杂交瘤细胞注射小鼠腹部等流程来制备腹水抗体。其次，其抗体纯度高于腹水抗体。再次，该抗体的制备过程获得了抗体基因序列，可利用哺乳动物细胞表达系统源源不断地表达重组完整抗体，避免了杂交瘤细胞突变和死亡等问题。最后，不同于已报道的针对农药的重组片段抗体，该重组完整抗体具有完整的“Y”型结构，可像天然抗体一样，便于进行修饰和标记，可用于开发稳定的免疫分析快速检测方法。附图说明图1为本专利技术以5’race技术反转录获得的cDNA为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。


2.根据权利要求1所述的抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.根据权利要求1或2所述的抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。


4.根据权利要求3所述的抗噻虫胺和呋虫胺宽谱抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。


5.一种抗噻虫胺和呋虫胺宽谱重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQIDNO:2所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：郭逸蓉，常云云，赵颖，刘鹏琰，柳颖，陈阳，朱国念，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33