靶向BCMA嵌合抗原受体的抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗体或其scFv或片段，该抗体可特异结合一种靶向BCMA的嵌合抗原受体(CAR)的胞外结合结构域scFv，而不与其它scFv或抗体序列有交叉反应。本发明专利技术还公开了该抗体在检测所述CAR中的应用。

【技术实现步骤摘要】
靶向BCMA嵌合抗原受体的抗体及其应用
本专利技术涉及靶向BCMA嵌合抗原受体的抗体，还涉及该抗体的编码核酸分子和其应用。
技术介绍
多发性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是仅次于非霍奇金淋巴瘤的第二常见恶性血液病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，目前用传统方法不可治愈，疾病进展较为迅速，中位生存时间仅3至4年[1-2]。嵌合抗原受体(ChimericAntigenReceptor,CAR)T细胞的过继疗法对于血液恶性肿瘤是一种突破性的新疗法。B细胞成熟抗原(BCMA)，又名CD269或TNFRSF17，是肿瘤坏死因子受体家族成员，被鉴定为嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的重要多发性骨髓瘤(MM)特异性靶标[3]。此前，我公司专利技术了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体(RD103ACAR，其胞外结构域称为RD103ACARscFv或RD103AscFv)，利用患者自身的T细胞，通过体外基因修饰后，将表达全人源103AscFv的CAR-T细胞回输到患者体内。103ACAR-T在临床前和临床研究中，效果非常显著。此产品正在准备在中国申报一期临床试验。鉴于其优秀的临床治疗效果，RD103CAR-T有望得到更广的应用，临床应用和市场价值巨大。在临床应用中，CAR基因能否表达、表达效率的高低、CAR-T细胞的活性和纯度都会直接影响CAR-T细胞对癌细胞的清除效率。临床研究证明，CAR-T细胞回输后在患者外周血中的增殖能力与疗效具有很强的相关性[4]。目前，主流的临床试验采用实时荧光定量PCR的方法检测外周血基因组中的CAR基因拷贝数，进而间接估算CAR-T细胞数量。qPCR的方法存在以下几个方面的问题：1)qPCR检测的是外周血PBMC基因组DNA中的CAR基因数量，而CAR的表达水平与基因组中的CAR基因含量与并不直接相关，甚至有可能发生基因沉默而导致的基因不表达；2)CAR在基因组中的拷贝数会因为不同CAR-T细胞克隆的增殖或凋亡而处于动态变化的过程，进一步导致通过检测外周血基因组中的CAR含量估算CAR-T细胞的误差；3)qPCR的方法难以对CAR-T细胞在体内的状态，如T细胞亚型进行进一步的分析，为CAR-T的深入研究带来困难。用带荧光标记的靶抗原(如FITC-BCMA)来估计CAR-T细胞数量也存在很大不确定性。主要原因是患者外周血中可能存在的拮抗BCMA抗原的抗体，或者细胞上表达BCMA的天然配体而产生假阳性信号。这些因素都会严重影响实验结果。还有一种情况是，当患者因疾病情况复杂而输注过多种CAR-T后，就无法用荧光标记的抗原去区分不同的CAR-T细胞数量了。因此，开发一种准确、快速的检测CAR表达情况的技术，对于该疗法的实施、监测以及深入研究具有重要意义。另一方面，CAR-T治疗完全缓解后一年内再次复发的比例很高，文献[5]中统计，不同的CD19CAR-T疗法，复发率为(4.6％至33.9％)。复发主要分为靶抗原阴性的复发和靶抗原阳性的复发。前者的原因是肿瘤细胞发生了抗原调低或丢失导致的CAR-T治疗失效；后者通常与CAR-T细胞在体内扩增和存续时间短相关。目前认为除了病人T细胞本身有缺陷之外，患者体内产生针对CAR-T细胞的抗体(Anti-DrugAntibody，ADA)和杀伤性的T细胞(CytotoxicTLymphocyte，CTL)是导致CAR-T快速失效的主要可能原因[5]。因此，检测回输病人体内是否产生了针对CAR-TscFv的ADA，并定量ADA浓度，可以分析ADA的浓度与CAR-T细胞存续之间的相关性，对于CAR-T产品的研究有重要意义。目前ADA检测主要是基于酶联免疫吸附测定(ELISA)。定量检测ADA的ELISA需要有标准参比品，也就是一个特异结合待检抗原的对照抗体。根据不同浓度对照抗体的ELISA读数制作标准曲线，我们才可以定量评估样品中的ADA浓度。
技术实现思路
在一方面，本文提供了一种抗体或其scFv或片段，该抗体的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：GFTFSSYA、ISGSGGST和ARGYMHAEHEKMEKSSRSDP，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SLRSTY、GKT和SSRDSSGYHYV。在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区包括SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述抗体的重链可变区包括SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包括SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。另一方面，本文提供了所述抗体或其scFv或片段在抗原检测中的应用，其中所述抗原包括SEQIDNO：12所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗原为融合蛋白的一部分。在一些实施方案中，所述融合蛋白为靶向BCMA的嵌合抗原受体，所述抗原为所述嵌合抗原受体的胞外结合结构域或其一部分。在一些实施方案中，所述应用包括：1)对表达所述嵌合抗原受体的培养T细胞进行定性和定量检测；2)在患者中检测表达所述嵌合抗原受体的T细胞的浓度，其中所述患者在所述检测前经表达所述嵌合抗原受体的T细胞输注治疗；或3)作为标准品用于在患者中检测所述患者体内针对所述嵌合抗原受体产生的抗体，其中所述患者在所述检测前经表达所述嵌合抗原受体的T细胞输注治疗。另一方面，本文提供了编码抗体或其scFv或片段的核酸分子，其中所述抗体的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列分别为：GFTFSSYA、ISGSGGST、和ARGYMHAEHEKMEKSSRSDP，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SLRSTY、GKT和SSRDSSGYHYV。在一些实施方案中，编码所述抗体的轻链可变区的序列包括SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，编码所述抗体的重链可变区的序列包括SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码所述scFv的序列包括SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。另一方面，本文提供了包括上述核酸分子的表达载体。本文提供的抗体作为独特型抗体特异靶向RD103AscFv，而不与其它scFv或抗体序列有交叉反应，有益于对RD103ACAR-T产品的药学研究。附图说明图1显示了本专利技术的大体研究流程图。图2显示了对富集的噬菌体抗体克隆进行ELISA初筛的结果。图3显示了噬菌体抗体克隆与细胞表面靶抗原(Jurkat-103AscFv)结合的FACS测定结果。图4显示了蛋白形式的抗体分子与靶抗原和无关抗原结合的ELISA测定结果。图5显示了蛋白形式的抗体分子与细胞表面靶抗原(Jurkat-103AscFv)结合的FACS测定结果。图6显示了蛋白形式的抗体分子与CA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗体或其scFv或片段，所述抗体的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3的氨基酸序列分别为：GFTFSSYA、ISGSGGST和ARGYMHAEHEKMEKSSRSDP，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SLRSTY、GKT和SSRDSSGYHYV。/n

【技术特征摘要】
1.抗体或其scFv或片段，所述抗体的重链可变区包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，轻链可变区包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、和HCDR3的氨基酸序列分别为：GFTFSSYA、ISGSGGST和ARGYMHAEHEKMEKSSRSDP，LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列分别为：SLRSTY、GKT和SSRDSSGYHYV。


2.如权利要求1所述的抗体或其scFv或片段，其中所述抗体的轻链可变区包括SEQIDNO：5所示的氨基酸序列，所述抗体的重链可变区包括SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。


3.如权利要求1所述的抗体或其scFv或片段，其中所述scFv包括SEQIDNO：4所示的氨基酸序列。


4.权利要求1至3任一项所述的抗体或其scFv或片段在抗原检测中的应用，其中所述抗原包括SEQIDNO：12所示的氨基酸序列。


5.如权利要求4所述的应用，其中所述抗原为融合蛋白的一部分。


6.如权利要求5所述的应用，其中所述融合蛋白为靶向BCMA的嵌合抗原受体，所述抗原为所述嵌合抗原受体的胞外结合结构域或其一部分。


7.如权利要求4至6任一项所述的应用，包括：

【专利技术属性】
技术研发人员：周剑锋，谭涛超，戴振宇，谢萌，汪胜义，魏振，
申请(专利权)人：南京驯鹿医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32