一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及血液净化领域，尤其涉及一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用。所述的单域抗体的氨基酸序列的结构通式如下：MDVQLQESGGG‑X

【技术实现步骤摘要】
一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用
本专利技术涉及血液净化领域，尤其涉及一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用。
技术介绍
超敏反应有着极大的发病人群，正影响着超过25％的世界总人口数。其中，I型变态反应亦称速发型过敏反应或过敏反应，是由IgE通过结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体而引起的一种免疫系统疾病，如临床常见的过敏性哮喘、过敏性荨麻疹、过敏性皮炎、过敏性鼻炎和青霉素引起的过敏性休克等。过敏反应发生时，患者体内的IgE浓度达到正常值的10倍以上，尤其是致敏原特异性IgE的浓度可以达到正常值的1000倍左右(GOULDHJ,SUTTONBJ等2003)。目前药物治疗是治疗过敏反应性疾病的主要方法，以采用免疫抑制剂类药物为主。这些药物疗法对偶发性过敏反应治疗效果良好，但对需要长期服药的过敏性哮喘等慢性、顽固性过敏疾病治疗副作用很大。近年来，血液吸附净化治疗由IgE介导的I型变态反应已成为一种选择趋势。德国美天旎公司和德国费森尤斯公司相继开发了特异性IgE吸附产品。单域抗体于1993年在哺乳类骆驼科(Camelidae)动物的体液免疫系统中发现，由单一的可变区、1个铰链区和2个恒定区(CH2和CH3)组成，分子量15KD。重链抗体具有易表达、可溶性好、稳定性强等优点，其结合亲和性接近传统抗体，可低至100pmol/L(GOULDHJ,SUTTONBJ等，2004)，近年来被广泛应用于药物研发等领域。
技术实现思路
因此，针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种抗人IgE蛋白的单域抗体及其应用，可对人体IgE进行特异性吸附。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种抗人IgE蛋白的单域抗体，所述的单域抗体的氨基酸序列的结构通式如下：MDVQLQESGGG-X1-LSC-X2-GRFTIS-X3-GQGTQVTVSS；其中X1为含1-9个氨基酸的氨基酸序列，X2为含1-43个氨基酸的氨基酸序列，X3为含1-38个氨基酸的氨基酸序列。含有本专利技术氨基酸序列结构通式：MDVQLQESGGG-X1-LSC-X2-GRFTIS-X3-GQGTQVTVSS的单域抗体，均可对人体IgE进行特异性吸附，从而达到清除IgE的目的。作为本专利技术所述的单域抗体的优选实施方式，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.10任一所示。另外，本专利技术提供了编码所述单域抗体的核苷酸。本专利技术还提供了一种免疫吸附剂，所述免疫吸附剂含有所述的单域抗体。作为本专利技术所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述免疫吸附剂是将所述单域抗体偶联至固相载体所得。作为本专利技术所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述固相载体为壳聚糖微球、琼脂糖微球、葡聚糖凝胶、树脂、纤维素微球中的至少一种。作为本专利技术所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述固相载体优选琼脂糖载体。琼脂糖载体因表面富含羟基，其生物相容性是最好的，适于血液净化方面的应用。作为本专利技术所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述偶联为采用环氧活化法进行偶联。通过活化后的环氧基接入乙二胺及戊二醛，增加了间隔臂长度，能够最大限度保证偶联量，提高填料的吸附性能。作为本专利技术所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述偶联的步骤如下：(1)取固相载体填料，加入碱性溶液、环氧氯丙烷溶液，反应后清洗填料，抽干；(2)往步骤(1)抽干后的填料中加入PBS溶液、乙二胺溶液，反应后清洗填料，抽干；(3)往步骤(2)抽干后的填料中加入PBS溶液、戊二醛溶液，反应后用反渗水清洗填料，抽滤；(4)往步骤(3)抽滤后的填料中加入所述单域抗体、碳酸盐缓冲液，反应后清洗填料，抽干。作为本专利技术所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述的碱性溶液为NaOH溶液。作为本专利技术所述的免疫吸附剂的优选实施方式，所述偶联的具体步骤如下：(1)取固相载体填料，加入3倍体积的2MNaOH，按照体积比1:0.3～1:0.9加入环氧氯丙烷溶液，35～42℃，100～200rpm，反应1～4h后清洗填料，抽干；(2)往步骤(1)抽干后的填料中加入等体积的PBS溶液，按照体积比1:0.3～1:0.9加入乙二胺溶液，35～42℃，100～200rpm，反应1～5h后清洗填料，抽干；(3)往步骤(2)抽干后的填料中加入等体积的PBS溶液，按照体积比1:1.0～1:2.0加入戊二醛溶液，35～42℃，100～200rpm，反应1～5h后用反渗水清洗填料，抽滤；(4)往步骤(3)抽滤后的填料中，按照投料量10mg/mL加入所述单域抗体蛋白溶液，缓冲液为与填料等体积的碳酸盐缓冲液，25～35℃，100～200rpm，反应1～5h后清洗填料，抽干。本专利技术还提供所述单域抗体在制备治疗和/或预防IgE引起的过敏性疾病的药物中的应用。作为本专利技术所述应用的优选实施方式，所述IgE引起的过敏性疾病包括哮喘、特应性皮炎、变应性支气管肺曲霉病、过敏性鼻炎、湿疹或荨麻疹、食物过敏。本专利技术还提供所述免疫吸附剂在血液净化领域中的应用。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术用真核表达的人IgEcε2-4区免疫羊驼，收集外周血单核细胞PBMC，通过分子生物学方法扩增出可变区序列，构建特异性的单域抗体噬菌体库。然后加入辅助噬菌体，通过包被人IgE，用ELISA板3-4轮淘选后，选择特异性高的菌株进行测序，获得单域抗体的基因序列。所构建的噬菌体库库容量达到1013，保证了基因的多样性，为后续筛选到特异性更好的序列奠定了良好的基础。(2)本专利技术用大肠杆菌或酵母菌作为宿主细胞，在体外重组表达单域抗体，筛选出可溶性表达的菌株。大肠杆菌优点是生产速度快，生产控制比较容易。也可以选用酿酒酵母进行表达，酿酒酵母是一种公认的不产生任何毒素的安全真核微生物，在生长过程中不分泌太多同源蛋白，可以简化下游处理过程。酵母含有内质网和高尔基体等类似哺乳动物细胞系统的分泌细胞器，可以有效形成分子内二硫键，产生糖基化的外源蛋白。(3)本专利技术通过噬菌体展示技术筛选到可用原核或真核表达的可溶性单域抗体，生产成本低。将所得到的单域抗体偶联至固相载体后合成的免疫吸附剂对人IgE的吸附量高，特异性好；且对人IgG的非特异性吸附较低，IgG是人免疫球蛋白中含量最高的，约7-16g/L，对IgG的吸附性能如果比较高会屏蔽抗体结合人IgE的位点，降低IgE吸附性能。本专利技术的IgE免疫吸附剂为治疗过敏性疾病提供了新的选择。附图说明图1：实施例3制备得到的单域抗体的SDS-PAGE电泳检测结果图；其中单域抗体的分子量为14KD。具体实施方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂盒生物材料，如无特本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗人IgE蛋白的单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体的氨基酸序列的结构通式如下：/nMDVQLQESGGG-X

【技术特征摘要】
1.一种抗人IgE蛋白的单域抗体，其特征在于，所述的单域抗体的氨基酸序列的结构通式如下：
MDVQLQESGGG-X1-LSC-X2-GRFTIS-X3-GQGTQVTVSS；
其中X1为含1-9个氨基酸的氨基酸序列，X2为含1-43个氨基酸的氨基酸序列，X3为含1-38个氨基酸的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.10任一所示。


3.编码权利要求1-2任一所述单域抗体的核苷酸。


4.一种免疫吸附剂，其特征在于，所述免疫吸附剂含有权利要求1-2任一所述的单域抗体。


5.根据权利要求4所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述免疫吸附剂是将所述单域抗体偶联至固相载体所得。


6.根据权利要求5所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述固相载体为壳聚糖微球、琼脂糖微球、葡聚糖凝胶、树脂、纤维素微球中的至少一种。

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【专利技术属性】
技术研发人员：张海珍，杨正根，陈臻毅，余波光，牛月伟，陈校园，
申请(专利权)人：广州康盛生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44