一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列及其重组完整抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还公开了一种抗噻虫啉重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术又公开了一种抗体表达质粒。将本发明专利技术得到的序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组完整抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗噻虫啉抗体可大批量稳定生产，为噻虫啉残留检测的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。

【技术实现步骤摘要】
一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列及其重组完整抗体
本专利技术属于基因工程
，尤其是涉及一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列及其重组完整抗体的制备。
技术介绍
噻虫啉(3-(6-氯-3-甲基吡啶)-1，3-噻唑烷-2-亚氰胺)是一种具有噻唑环的新型氯代烟碱类杀虫剂，因其结构独特，性能与传统烟碱类杀虫剂相比更为优异，而被广泛应用于防治刺吸式口器和咀嚼式口器害虫对农作物的危害。噻虫啉有较强的内吸和渗透作用，因此会分布在作物各个部位，且因其具有水溶性强和半衰期长等特点，很容易通过降雨和灌溉等途径进入到地表水和土壤中。研究表明，地表水、沉积物和土壤中存在着较高水平的噻虫啉残留，这些农药残留对蜜蜂等传粉动物、水生和土壤无脊椎动物造成了巨大威胁。还有研究认为，噻虫啉对人类具有潜在致癌性及可能的生殖毒性与内分泌干扰效应，因此2020年欧盟开始实施对噻虫啉的禁用令。为防止消费者和有益生物受到噻虫啉残留的危害，对环境和农产品中噻虫啉残留的及时监测具有重要的意义。目前，针对噻虫啉残留的检测方法主要有基于仪器的检测方法和基于免疫分析的检测方法。仪器分析方法有HPLC、GC和MS等，这些仪器分析方法均具有很高精密度、准确度和灵敏度，能够满足噻虫啉的精准定性定量的检测要求，但仪器分析方法需要昂贵的分析仪器、专业的实验人员和复杂的样品前处理程序，因此很难实现大规模的现场快速分析，而免疫分析快速检测方法能满足农药残留现场检测以及大批量样本筛查的需求。目前，已有抗噻虫啉单抗及其免疫快速检测方法的少量公开报道，例如Yin等人报道的基于噻虫啉抗体和抗原模拟表位多肽建立的ELISA方法对噻虫啉的检测灵敏度(IC50)和最低检测限(IC10)分别是26.3和1.4μg/L(Yin,W.；Hua,X.；Liu,X.；Shi,H.；Gee,S.J.；Wang,M.；Hammock,B.D.,Anal.Biochem.,2015,481,27–32.)。Ding等人报道的基于传统单抗建立的ELISA方法对噻虫啉的IC50和IC10分是2.31ng/mL和0.44ng/mL(Ding,Y.；Chen,H.；Yang,Q.；Feng,L.；Hua,X.；Wang,M.,RSCAdv.,2019,9,36825–36830.)。农药免疫分析快速检测技术是基于农药抗原和抗体的特异性结合而实现的，故抗体的制备是农药免疫快速检测的核心关键。传统的抗体有多克隆抗体和单克隆抗体，均是通过免疫动物而制备的，且后者因只有一个抗原识别表位特异性强而被广泛应用于农药免疫分析快速检测。依赖杂交瘤细胞制备单克隆抗体这一技术生产成本高、耗时，且需要杂交瘤细胞的长期低温保存和定期驯化，但在这些过程中杂交瘤细胞会因保存条件不当，有效基因丢失或突变而无法产生有效的抗体。随着基因工程技术的发展，序列明确的重组抗体逐渐变成研究热点，包括单链抗体、Fab抗体、重组完整抗体等。在众多重组抗体表达系统中，哺乳动物细胞表达系统能够指导重组抗体的正确折叠，提供准确的多种翻译后的加工和修饰功能，因此可以稳定产生与亲本抗体活性一致的重组抗体，不仅证实了亲本抗体可变区序列的准确性，还可以解决常规抗体制备面临的许多问题，如传统抗体的批次间差异、细胞株传代保存过程中容易丢失有效基因而导致细胞株无法产生有效抗体。只要获得正确的抗体序列基因，就可以在体外大量制备多种形式的重组抗体(包括全长IgG完整抗体、单链抗体scfv、抗原识别片段Fab等)，而无需牺牲小鼠来制备腹水抗体，操作简便，制备周期短，有利于大规模产生抗体，并有助于灵敏、可靠的农药残留快速检测技术的发展和应用。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术提供一种灵敏度高、特异性强的抗噻虫啉重组完整抗体的制备方法和稳定生产，以及该抗体的应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。作为优选，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。作为优选，轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。作为优选，轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还公开了一种抗噻虫啉重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQIDNO:2所示。作为优选，所述重链可变区编码基因的核苷酸序列为如SEQIDNO:1所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。作为优选，所述轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术又公开了一种抗体表达质粒，含有上述任一项所述的重链可变区和小鼠重链IgG1恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫啉重组完整抗体的重链蛋白；或者，含有如权利要求3-4中任一项所述的轻链可变区和小鼠轻链Lambda恒定区的核苷酸序列，可以表达抗噻虫啉重组完整抗体的轻链蛋白。本专利技术将一株能稳定分泌抗噻虫啉高特异、高灵敏单抗的杂交瘤细胞株的重链和轻链可变区基因成功扩增出来、测序和合成，采用同源重组技术分别构建了重链和轻链表达载体，并共转染至哺乳动物细胞HEK293F中，最终获得抗噻虫啉的重组完整抗体。经ELISA技术验证，该重组完整抗体与传统的抗噻虫啉小鼠腹水单抗相比，有一致的高灵敏度和高选择性，可以代替腹水单抗，应用于噻虫啉农药残留检测。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术公开的抗噻虫啉重组完整抗体的重链可变区、轻链可变区序列来源于经多次免疫小鼠、细胞融合及筛选得到的一株高特异性的抗噻虫啉的单克隆细胞株。将此序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组完整抗体，保证了鼠源亲本抗体的识别活性，并使得抗噻虫啉抗体可大批量稳定生产，为噻虫啉残留检测的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。附图说明图1为本专利技术以反转录获得的cDNA为模板，噻虫啉抗体重链可变区基因、轻链可变区基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳结果。图2为本专利技术SDS-PAGE验证完整抗体在哺乳动物细胞HEK293F中的表达。图3为本专利技术抗噻虫啉重组完整抗体和小鼠单克隆抗体对噻虫啉的ELISA竞争曲线(浓度从低到高依次为0.01，0.05，0.20，0.78，3.13，12.50，50μg/L)。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围，如无特殊说明，实施例中的实验方法均为常规方法。本专利技术涉及的抗噻虫啉重组完整抗体包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其重链恒定区序列为小鼠I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。


2.根据权利要求1所述的特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列，其特征在于：重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.根据权利要求1或2所述的特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQIDNO:4所示。


4.根据权利要求3所述的特异性抗噻虫啉抗体的可变区序列，其特征在于：轻链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。


5.一种抗噻虫啉重组完整抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQIDNO:2所示。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭逸蓉，刘鹏琰，赵颖，郭源昊，焦沙沙，柳颖，朱国念，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33