一种生物催化制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物催化制备(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的方法，以重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以间三氟甲基苯乙酮为底物，加入辅助底物，以pH 6.0～8.0磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于20～40℃、200rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇；本发明专利技术当底物浓度为400mM时，产物(R)‑1‑(3‑三氟甲基苯基)乙醇的产率为74.2％，e.e.值>99.9％，表现出更优的催化效率。

【技术实现步骤摘要】
一种生物催化制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法(一)
本专利技术涉及一种(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的制备方法，特别涉及利用重组大肠杆菌高选择性生物催化间三氟甲基苯乙酮不对称还原制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法。(二)技术背景(R)-3-(1-(3-(三(三氟甲基)苯基)乙氧基)氮杂环丁烷-1-羧酰胺是一种神经保护类化合物，可用于治疗脑缺血、中枢神经系统损伤或眼疾。在小鼠永久性MCAo模型中，闭塞前30分钟给药时，该化合物以60mg/kg的剂量显示出显著的神经保护作用。(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇((R)-MTE-PEL)，分子式C9H9F3O，CAS号：127852-24-8，是制备该神经保护剂的关键手性中间体。来国桥等人以手性呋喃亚胺和醋酸锌反应生成的络合物为催化剂，还原间三氟甲基苯乙酮得到(R)-1-(3-(三氟甲基苯基)乙醇。底物间三氟甲基苯乙酮的浓度为500mM，反应时间为45h，收率为81％，光学纯度为60％，该方法得到的产物对映体选择性偏低反应时间较长。盖萍等人筛选得到一株氧化微杆菌C3(MicrobacteriumoxydansC3)，可不对称还原底物间三氟甲基苯乙酮为(R)-1-(3-(三氟甲基苯基)乙醇，反应的底物浓度较低，仅为5mM，37℃转化24h，底物转化率和e.e.值分别为88％和99％。许建和等人利用来源于耐热克鲁维酵母(Kluyveromycesthermotolerans)CGMCC2.1492羰基还原酶构建的重组大肠杆菌细胞，对底物间三氟甲基苯乙酮进行生物还原，底物浓度为10mM，30℃反应12h，底物转化率为99％，e.e.值大于99％。目前报道的利用微生物细胞催化制备(R)-1-(3-(三氟甲基苯基)乙醇存在催化底物浓度偏低，催化效率不理想等问题。低共熔溶剂是由氢键受体(HBA)和氢键供体(HBD)之间通过氢键作用而形成的透明均一液态共熔盐。它具有比常规有机溶剂和离子液体更优越的性能，例如，低熔点，可设计性，良好的生物相容性，易于制备，稳定性高且环境友好。天然低共熔溶剂主要是由天然的初级代谢产物组成，例如糖，糖醇，有机酸，氨基酸和胺，通常还含有一定摩尔比的水，它具有比一般低共熔溶剂更佳的生物相容性和可持续性。本专利技术利用源于雷弗松氏菌短链脱氢酶构建的重组大肠杆菌工程菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR静息细胞为催化剂，在含氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)低共熔溶剂-缓冲液介质体系中转化间三氟甲基苯乙酮制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇((R)-MTE-PEL)。由于低共熔溶剂可改变作为催化剂的微生物细胞膜通透性，减少底物和产物的抑制作用，从而可进一步提高还原反应效率。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种利用重组大肠杆菌催化间三氟甲基苯乙酮不对称还原制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的新方法。该方法较化学还原法具有立体选择性高，催化剂制备成本低，反应条件温和、操作简单、环境友好等优点，并且可催化的底物浓度以及产物的产率和e.e.值均较高。本专利技术采用的技术方案：本专利技术提供一种生物催化制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇((R)-MTE-PEL)的方法，所述方法为：以源于雷弗松氏菌的短链脱氢酶(LXCAR)构建的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以间三氟甲基苯乙酮为底物，加入辅助底物，以pH6.0～8.0(优选pH7.5)磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于20～40℃、200rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇产物；所述辅助底物为葡萄糖、甘油、麦芽糖、乳糖、异丙醇、乙醇或正丁醇中的一种，优选异丙醇；所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR。进一步，所述催化剂加量以转化体系总体积计为20～160g/L(优选160g/L)；所述底物加量以转化体系总体积计为50～400mmol/L(优选400mmol/L)；所述辅助底物为葡萄糖、麦芽糖、乳糖时，加入量以转化体系总体积计为100g/L；所述辅助底物为甘油时，加入量以转化体系总体积计为60g/L；所述辅助底物为异丙醇、乙醇或正丁醇时，体积加入量以转化体系总体积计为5～30％(优选10％)。更进一步，所述转化体系由催化剂、底物、辅助底物、低共熔溶剂和磷酸缓冲液构成，所述低共熔溶剂加入量以转化体系总体积计为1～10％(优选4％)。所述低共熔溶剂组成中的氢键受体(HBA)和氢键供体(HBD)摩尔比为1:1。所述低共熔溶剂中的HBA为氯化胆碱、甜菜碱、L-肉碱、L-脯氨酸中之一，HBD为天然氨基酸、异丙醇、尿素、果糖、海藻糖、葡萄糖、甘油中之一。本专利技术所述低共熔溶剂优选为下列之一：氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)、氯化胆碱：尿素(ChCl:U)、氯化胆碱：异丙醇(ChCl:IPA)、氯化胆碱：甘氨酸(ChCl:Gly)、氯化胆碱：丙氨酸(ChCl:Ala)、氯化胆碱：色氨酸(ChCl:Trp)、氯化胆碱：酪氨酸(ChCl:Tyr)、氯化胆碱：谷氨酸(ChCl:Glu)、氯化胆碱：谷胱甘肽(ChCl:GSH)、氯化胆碱：果糖(ChCl:Flu)、氯化胆碱：海藻糖(ChCl:Myc)、甜菜碱：异丙醇(B:IPA)、甜菜碱：半胱氨酸(B:Cys)、甜菜碱：丙氨酸(B:Ala)、甜菜碱：赖氨酸(B:Lys)、甜菜碱：谷氨酸(B:Glu)、L-肉碱：赖氨酸(C:Lys)、L-脯氨酸：赖氨酸(P:Lys)、L-肉碱：葡萄糖：甘油(C:Glc:G)，摩尔比均为1:1。优选低共熔溶剂种类为氯化胆碱：赖氨酸(ChCl:Lys)。本专利技术所述重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR的构建过程详见申请人在先前专利申请(CN104212841A，公开日期2014年12月17日)。所述催化剂的制备方法为：重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1％的接种量接种到新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD600为0.6～0.9后，向培养液中加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，30℃、200rpm下诱导培养10h。培养结束后，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体，即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR湿菌体。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术利用重组大肠杆菌全细胞为催化剂，通过生物不对称还原间三氟甲基苯乙酮制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇。该方法具有产物立体选择性高，工艺简单，环境友好，反应产率高等优点，并且在生物还原过程中通过添加价廉的辅助底物，可实现辅酶的原位再生。同时在反应介质体系中加入低共熔溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物催化制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法，其特征在于所述方法为：以重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以间三氟甲基苯乙酮为底物，加入辅助底物，以pH 6.0～8.0磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于20～40℃、200rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇；所述辅助底物为葡萄糖、甘油、麦芽糖、乳糖、异丙醇、乙醇或正丁醇中的一种；所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR。/n

【技术特征摘要】
1.一种生物催化制备(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇的方法，其特征在于所述方法为：以重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以间三氟甲基苯乙酮为底物，加入辅助底物，以pH6.0～8.0磷酸缓冲液为反应介质构成转化体系，于20～40℃、200rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应结束后，反应液经分离纯化得到(R)-1-(3-三氟甲基苯基)乙醇；所述辅助底物为葡萄糖、甘油、麦芽糖、乳糖、异丙醇、乙醇或正丁醇中的一种；所述重组大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述催化剂加量以转化体系总体积计为20～160g/L；所述底物加量以转化体系总体积计为50～400mmol/L；所述辅助底物为葡萄糖、麦芽糖、乳糖时，加入量以转化体系总体积计为100g/L；所述辅助底物为甘油时，加入量以转化体系总体积计为60g/L；所述辅助底物为异丙醇、乙醇或正丁醇时，体积加入量以转化体系总体积计为5～30％。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述转化体系由催化剂、底物、辅助底物、低共熔溶剂和磷酸缓冲液构成；所述低共熔溶剂组成中的氢键受体和氢键供体的摩尔比为1:1；所述氢键受体为氯化胆碱、甜菜碱、L-肉碱、L-脯氨酸中的一种，所述氢键供体为天然氨基酸、异丙醇、尿素、果糖、海藻糖、葡萄糖、甘油中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王普，庄文锦，张莹，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33