本发明专利技术涉及R/S‑泛酸内酯的对映选择性乙酰化，具体涉及以一种方法由(R/S)‑泛酸内酯的转化形成高度富集的(R)‑泛酸内酯乙酸酯，所述方法包括(1)使用对映选择性乙酰化酶进行动力学拆分；以及(2)在至少一种特定化学催化剂的存在下进行(S)‑泛酸内酯的外消旋化，其中两个步骤都可以在一锅反应/系统中进行。
【技术实现步骤摘要】
R/S-泛酸内酯的对映选择性乙酰化本专利技术涉及以一种方法由(R/S)-泛酸内酯的转化形成高度富集的(R)-泛酸内酯乙酸酯，所述方法包括(1)使用对映选择性乙酰化酶动力学拆分和(2)在至少一种特定的化学催化剂的存在下进行(S)-泛酸内酯的外消旋化，其中两个步骤都可以在一锅反应/系统中进行。泛酸酯或维生素B5是维生素的B复合物的成员，其对包括人类的哺乳动物是必不可少的。它必须作为食品或饲料添加剂提供。在细胞中，泛酸酯主要用于辅酶A和酰基载体蛋白的生物合成。这些必需的辅酶在酰基片段的代谢中起作用，酰基片段与这些分子的4'-磷酸泛酰巯基乙胺部分的巯基形成硫酯。重要的是，只有(R)-泛酸酯作为维生素具有生物活性。泛酸酯通常经由化学合成由散装化学品合成。然而，对于化学合成所需的底物昂贵且外消旋中间体必须光学拆分。产生泛酸酯生物合成过程中所用酶的细菌或微生物体系(如果有的话)，由于所用酶的收率和/或选择性不足，尚不能用于工业生产。因此，需要在工业规模中使用且无需进一步拆分和/或纯化步骤的针对(R)-泛酸内酯的对映选择性生产的更有效和更简单的方法。令人惊讶地，我们现在确定了一种方法，其中外消旋泛酸内酯与乙酸酯一起可以被转化成泛酸内酯乙酸酯，其在(R)-构象中的百分数至多100％，所述方法包括以下步骤：(1)使用(R)-选择性酶进行(R/S)-泛酸内酯和乙酸酯的对映选择性醇解和(2)使用作为(化学)催化剂的特定的过渡金属配合物进行(S)-泛酸内酯的外消旋化。可以通过本领域已知的方法将(R)-泛酸内酯乙酸酯进一步转化成(R)-泛酸内酯。特别地，本专利技术涉及(1)经由具有羧酸酯水解酶[EC3.1.1]活性的酶的催化作用转化外消旋(R/S)-泛酸内酯的方法，其中(R/S)-泛酸内酯和乙酸酯经由对映选择性醇解选择性转化成(R)-泛酸内酯-乙酸酯。为了本专利技术的目的，即如步骤(1)和如本文所述，外消旋泛酸内酯和乙酸酯对映选择性醇解为(R)-泛酸内酯乙酸酯，可以使用从各种来源分离的[EC3.1.1]类的任何酶，特别是从包括酵母、细菌或高等真核生物的真菌分离的这种酶。优选地，该酶选自脂肪酶[EC3.1.1.3]类。根据[EC3.1.1.3]的酶天然参与脂质和蜡酯中酯键的水解，但也可以使用于化学合成的多种含酯键的底物催化水解、酸解、醇解和酯交换反应。在一个实施方式中，步骤(1)中使用且如本文定义的对映选择性酶选自假丝酵母(Candida)，优选地南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶A(CalA)，更优选地具有与SEQIDNO:1至少约80％，例如85、90、95、98或100％同一性的多肽，包括编码所述多肽的多核苷酸，例如SEQIDNO:2的多核苷酸。CalA可从各种供应商，例如Novozymes或Merck市售可得。术语“脂肪酶”或“具有脂肪酶活性的酶”、“泛酸内酯水解酶”、“醇解酶”、“对映选择性酶”、“(R)-选择性酶”，或“(R/S)-泛酸内酯转酯酶”在本文中可互换使用。它是指具有脂肪酶活性的酶，其涉及(R/S)-泛酸内酯和乙酸酯对如本文定义的(R)-泛酸内酯乙酸酯的转化，即对映选择性醇解/乙酰化。术语“CalA”和“南极假丝酵母脂肪酶A”在本文中可互换使用。用于(R/S)-泛酸内酯的乙酰化的合适的乙酸酯选自不饱和、饱和或芳族乙酸酯，包括但不限于乙酸乙烯酯、乙酸苯基乙烯酯、乙酸乙氧基乙烯酯、乙酸异戊烯酯、乙酸异丙烯酯、乙酸乙酯或乙酸对氯苯基酯，优选乙酸乙烯酯。如本文定义的(R/S)-泛酸内酯和乙酸酯对(R)-泛酸内酯乙酸酯的酶促转化，即如本文所述的对映选择性醇解，可以用分离的酶，例如如本文定义的羧酸酯水解酶或醇解酶，特别是脂肪酶，例如CalA进行，所述酶可以在合适的宿主细胞，例如酵母或细菌，优选毕赤酵母(Pichia)或大肠杆菌(Escherichia)中，例如作为异源酶来表达。特别地，如本文所述的对映选择性酶在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)中是异源表达的。合适的酶的分离可以通过已知方法进行，相应的酶可以以分离的形式或以细胞提取物、粉末或液体制剂的形式，即以固定或非固定形式进一步使用。优选地，如本文定义的酶(改性或未改性的)，例如用于如本文定义的(R/S)-泛酸内酯和乙酸酯的对映选择性乙酰化的方法中使用的CalA以分离的形式，例如以液体或固定形式，例如共价结合或吸附，例如在环氧载体上使用，这取决于供应商。当使用固定形式时，酶可以以大致相同的性能使用几次(所谓的回收)。所描述的酶形式适用于改性和未改性的酶二者。与步骤(1)有关的术语“转化”、“醇解”、“乙酰化”、“酯交换”、“对映选择性乙酰化”或“对映选择性醇解”，即如本文所述的酶[EC3.1.1.3]，特别是[EC3.1.1.3]的酶促催化(导致由如本文定义的外消旋泛酸内酯和乙酸酯对映选择性生产(R)-泛酸内酯乙酸酯)在本文中可互换使用。如本文所用，术语“转化率”是指脂肪酶，特别是CalA的活性，其可以作为(R/S)-泛酸内酯向泛酸内酯乙酸酯的转化来测量。如本文所用的术语“E值”(E)是指与转化率无关的酶的一般对映选择性。如本文使用的“对映体过量”(ee)是指其中样品含有比另一种对映体(例如(S)-泛酸内酯)更高量的一种对映体(例如(R)-泛酸内酯)的程度，参见关于选择性的帮助文件(UniGraz,2012:http://biocatalysis.uni-graz.at/enantio/DataFiles/Selectivity-Help.pdf)。术语“外消旋(R/S)-泛酸内酯”是指包含任何比率的(R)和(S)-泛酸内酯的混合物，包括其中(R)和(S)-对映异构体以等量存在的混合物，即所谓的外消旋体。如本文所用，关于酶的术语“比活性”或“活性”是指其催化活性，即其催化从给定底物形成产物的能力。比活性定义在限定的温度下在给定的时间段内且每限定量的蛋白质消耗的底物和/或产生的产物的量。通常，比活性以每毫克蛋白质每分钟消耗的微摩尔底物或形成的产物表示。通常，μmol/min缩写为U(＝单位)。因此，μmol/min/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活度的单位定义在本文档中可互换使用。如果酶在体内即在如本文定义的宿主细胞内或在合适的底物存在下的体外系统内执行其催化活性，则该酶是有活性的。技术人员知道如何测量酶活性，特别是如本文定义的醇解酶的活性，例如特别是CalA活性。评估如本文定义的合适酶对于如本文定义的从(R/S)-泛酸内酯和乙酸酯的醇解形成(R)-泛酸内酯乙酸酯的能力的分析方法是本领域已知的。本专利技术涉及根据步骤(1)的用于(R/S)-泛酸内酯的对映选择性醇解的方法，其中将如本文定义的(R/S)-泛酸内酯和乙酸酯酶促转化成泛酸内酯乙酸酯和(S)-泛酸内酯，其转化率为至少约20，例如至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65或至多70％范围内的外消旋泛酸内酯转化成泛酸内酯乙酸酯。优选地，泛酸内酯乙酸酯作为(R)-对映体存在，优选的E值大于约1，例如1.5、2、3、5、6、8、9、10、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于生产(R)-泛酸内酯乙酸酯的方法，包括以下步骤：(1)使用具有脂肪酶[EC3.1.1.3]活性的(R)-选择性酶进行(R/S)-泛酸内酯和乙酸酯的对映选择性醇解，优选转化率为至少约20％，和(2)在作为(化学)催化剂的至少一种特定过渡金属配合物的存在下进行(S)-泛酸内酯的外消旋化。/n
【技术特征摘要】
20190607 EP 19178974.21.一种用于生产(R)-泛酸内酯乙酸酯的方法，包括以下步骤：(1)使用具有脂肪酶[EC3.1.1.3]活性的(R)-选择性酶进行(R/S)-泛酸内酯和乙酸酯的对映选择性醇解，优选转化率为至少约20％，和(2)在作为(化学)催化剂的至少一种特定过渡金属配合物的存在下进行(S)-泛酸内酯的外消旋化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)的所述酶选自南极假丝酵母(Candidaantarctica)，优选CalA，更优选与SEQIDNO:1具有至少约80％，例如85、90、95、98或100％同一性的酶。
3.一种根据权利要求1或2中的步骤(1)催化外消旋泛酸内酯和乙酸酯转化成(R)-泛酸内酯乙酸酯的对映选择性醇解酶，所述酶具有脂肪酶[EC3.1.1.3]活性和至少约1.5的E值。
4.根据权利要求3所述的酶，所述酶在底物结合区中包含一个或多个氨基酸取代。
5.根据权利要求4所述的酶，所述一个或多个氨基酸取代位于与选自由根据SEQIDNO:1的多肽中的211、223、326、327位及它们的组合组成的组的一个或多个残基对应的一个或多个位置。
6.根据权利要求5所述的酶，所述一个或多个氨基酸取代位于与选自由根据SEQIDNO:1的多肽中的223、326位及它们的组合组成的组的一个或多个残基对应的一个或多个位置。
7.根据权利要求6所述的酶，其中所述一个或多个氨基酸取代选自与选自由根据SEQIDNO:1的多肽中的211、223、326、327位及它们的组合组成的组的一个或多个残基对应的T211K、T211Q...
【专利技术属性】
技术研发人员：芮妮·马赛尔·德容，乔纳森·艾伦·米德洛克，莫妮卡·穆勒，多米尼克·莫尼克·查尔斯·卡兰特，琳达·安德莉亚·劳拉·维莫特，马丁·苏尔曼，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL
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