一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用微生物转化制备β‑猪去氧胆酸的方法，该方法通过微生物转化将猪去氧胆酸在3位的羟基由α位转化为β位。步骤包括：孢子和种子制备；α‑猪去氧胆酸微生物转化；分离提纯。本发明专利技术方法操作简单，以资源丰富、价格低廉的α‑猪去氧胆酸为原料，通过生物转化获得β‑猪去氧胆酸，有利于实现β‑猪去氧胆酸的工业化生产，促进β‑猪去氧胆酸的开发利用。

【技术实现步骤摘要】
一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法
本专利技术属于微生物转化
，具体的涉及一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法，是利用微生物将猪去氧胆酸在3位的羟基由α位转化为β位。
技术介绍
α-猪去氧胆酸（3α,6α-二羟基胆烷酸，HDCA）经由猪胆汁提取、加工制成，具有降血脂、祛痰、镇咳作用。α-猪去氧胆酸对百日咳杆菌、白喉杆菌、金黄色葡萄球菌等有一定抑制作用，可用作消炎药，治疗慢性支气管炎、小儿病毒性上呼吸道炎症等。目前，α-猪去氧胆酸的提取和制备工艺较为成熟，工业上实现了规模性加工生产，基于其自身的特性，还可作为人工牛黄配方的重要原料，以及其他中药制剂成分，如药物清开灵等。3β,6α-二羟基胆烷酸（β-HDCA）是α-猪去氧胆酸的同分异构体，在天然猪胆汁中仅有微量存在，且目前β-猪去氧胆酸的制备主要通过化学法合成，工艺复杂、环境污染大，产量低，无法实现大规模生产。正是由于其生产条件受限，导致其应用也受限，目前β-猪去氧胆酸仅作为标准品和杂质对照品，在市面上少量出售，不能满足某些特殊行业的需求。生物转化是利用生物体系（包括植物、微生物或动物组织的培养体系）或生物体系的相关酶制剂对外源有机底物某一特定部位或功能基团进行特异性的结构修饰以获得有价值产物的生理、生化反应。酶法具有化学法无法比拟的优点，如条件温和，化学、区域和立体选择性高，操作简单，环境友好等，因此，如何将生物转化技术运用于β-猪去氧胆酸的制备，是行业内目前亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法，以解决上述背景中提出的，目前β-猪去氧胆酸的制备主要通过化学法合成，工艺复杂、环境污染大，产量低，无法实现规模化生产的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法，其特征在于，具体的制备过程如下：（1）孢子和种子的制备用接种环挑取球形芽孢杆菌AKU218的菌丝体在PDA平板上划线，于28℃的恒温培养箱中培养，培养3-5天，得到球形芽孢杆菌AKU218平板。所述的球形芽孢杆菌AKU218属于现有菌种，不是本专利技术想要保护的范围，其菌种信息在此不作详细描述。（2）α-猪去氧胆酸的微生物转化A.在无菌条件下，用消毒后的接种环，挑取一环步骤（1）中制备的球形芽孢杆菌AKU218的菌丝体，接种在灭菌后的细菌培养基中，于28℃，120rpm条件下恒温震荡培养48-72小时，于3000rpm条件下离心10分钟后，分离回收菌体；B.将步骤A所得的菌体分散于无机盐培养基中，所述无机盐培养基中加入已事先溶解的α-猪去氧胆酸及β-氧化抑制剂2,2’-Bipyridyl，然后将上述无机盐培养基放入置有脱氧剂的密闭容器中，于28℃，120rpm的厌氧条件下培养36-72小时。（3）转化产物的分离提纯在步骤B培养后的无机盐培养基中，添加等体积的乙酸乙酯进行抽提分离，分离后的产物经脱色纯化后为白色粉末状的β-猪去氧胆酸，且α-猪去氧胆酸转化为β-猪去氧胆酸的转化率为80%-90%。进一步的，步骤A中所述细菌培养基包括以下组分：胰蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，糖类1g/L，磷酸氢二钾1g/L。进一步的，步骤B中所述无机盐培养基包括以下组分：磷酸氢二钾1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸铵1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钠0.1g/L，二水氯化钙0.02g/L，七水硫酸铁0.01g/L，酵母膏0.25g/L。进一步的，步骤B中所述的α-猪去氧胆酸及β-氧化抑制剂2,2’-Bipyridy事先溶解于乙醇中，其中α-猪去氧胆酸的浓度为0.1%-1.0%，β-氧化抑制剂2,2’-Bipyridy的浓度为0.01%。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术首次提出利用微生物转化方法将猪去氧胆酸3号位α羟基转化为β位羟基，以资源丰富、价格低廉的α-猪去氧胆酸为原料，通过生物转化获得β-猪去氧胆酸，制备过程简单便捷、成本低廉，有利于实现β-猪去氧胆酸的工业化生产，促进β-猪去氧胆酸的开发利用，具有较大的社会价值和经济价值。将乙酸乙酯抽提液与含有0.1%脂肪酸分析用荧光试剂ADAM甲醇溶液混合后，添加甲醇，于室温下静置60分钟形成荧光标记。荧光标记后样品进行HPLC、LC-MS、GC-MS分析，并与新购入标准样的β-猪去氧胆酸采用同样方法进行分析，结果证明α-猪去氧胆酸经球形芽孢杆菌发酵后能转化为β-猪去氧胆酸。附图说明图1是球形芽孢杆菌AKU218的HDCA转化反应图；图2是市场标准样与球形芽孢杆菌AKU218的转化产物的HPLC比较图；图3是β-HDCA的LC-MS分析图；图4是HDCA、β-HDCA标准品及转化产物的GC-MS分析图；图5是标准品与转化产物的MS图谱比较图。图1中：线1、标准样(自左向右CA、UDCA、HDCA、DCA、CDCA、LCA)；线2、厌氧反应产物；线3、好氧反应产物。图2中：线4、标准样(自左向右UDCA、HDCA、CDCA、LCA)；线5、β-猪去氧胆酸标准样；线6、球形芽孢杆菌AKU218反应产物。图3中：线7、TCI（-）；线8、m/z617；线9、m/z619。图4中：线10、HDCA标准品；线11、球形芽孢杆菌转化产物；线12、3β-HDCA标准品。图5中：上部线条为3β-HDCA标准品；下部线条为球形芽孢杆菌转化产物。具体实施方式下面将结合实施例,对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法，具体的制备过程如下：（1）孢子和种子的制备取去皮马铃薯200g,加入200ml去离子水煮沸，维持25min；用灭菌过的双层纱布趁热过滤，滤渣丢弃，保留滤液；滤液中加入葡萄糖20g、琼脂20g，石棉网上小火加热，不断用玻璃棒搅拌，直到全部溶解，加去离子水定容至1000ml；将配置好的培养基分装倒入500mL锥形瓶中，用棉塞堵住瓶口，在棉塞外包裹一层牛皮纸，标明培养基名称、配置日期和配置人；灭菌锅内115℃下灭菌30min，待培养基冷却至50°C左右后，无菌操作倒平板（每皿约倒15ml），室温平置，待凝后制得PDA平板；用接种环挑取球形芽孢杆菌AKU218的菌丝体在PDA平板上划线，于28℃恒温培养箱中，培养3天，得到球形芽孢杆菌AKU218平板。（2）α-猪去氧胆酸的微生物转化步骤如下：玻璃试管中倒入4ml灭菌后的细菌培养基，细菌培养基配方见表1，用酒精灯灼烧冷却后的接种环，挑取一环步骤（1）中制备的球形芽孢杆菌AKU218的菌丝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法，其特征在于，具体的制备过程如下：/n（1）孢子和种子的制备/n用接种环挑取球形芽孢杆菌AKU218的菌丝体在PDA平板上划线，于恒温培养箱中培养，得到球形芽孢杆菌AKU218平板；/n（2）α-猪去氧胆酸的微生物转化/n从步骤（1）的球形芽孢杆菌AKU218平板上，挑取一环步骤（1）中制备的球形芽孢杆菌AKU218的菌丝体，接种在灭菌后的细菌培养基中，恒温震荡培养48-72小时，离心分离回收菌体；然后将回收菌体接种到含有α-猪去氧胆酸及β-氧化抑制剂 2,2’-Bipyridyl的无机盐培养基中发酵；/n（3）转化产物的分离提纯/n在步骤（2）中培养后的无机盐培养基中，添加等体积的乙酸乙酯进行抽提分离，分离后的产物经脱色纯化后为白色粉末状的β-猪去氧胆酸，且α-猪去氧胆酸转化为β-猪去氧胆酸的转化率为80%-90%。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法，其特征在于，具体的制备过程如下：
（1）孢子和种子的制备
用接种环挑取球形芽孢杆菌AKU218的菌丝体在PDA平板上划线，于恒温培养箱中培养，得到球形芽孢杆菌AKU218平板；
（2）α-猪去氧胆酸的微生物转化
从步骤（1）的球形芽孢杆菌AKU218平板上，挑取一环步骤（1）中制备的球形芽孢杆菌AKU218的菌丝体，接种在灭菌后的细菌培养基中，恒温震荡培养48-72小时，离心分离回收菌体；然后将回收菌体接种到含有α-猪去氧胆酸及β-氧化抑制剂2,2’-Bipyridyl的无机盐培养基中发酵；
（3）转化产物的分离提纯
在步骤（2）中培养后的无机盐培养基中，添加等体积的乙酸乙酯进行抽提分离，分离后的产物经脱色纯化后为白色粉末状的β-猪去氧胆酸，且α-猪去氧胆酸转化为β-猪去氧胆酸的转化率为80%-90%。


2.根据权利要求1所述的一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（1）中恒温培养箱中温度为28℃，培养时间为3-5天。


3.根据权利要求1所述的一种利用微生物转化制备β-猪去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤（2）中α-猪去氧胆酸的微生物转化的具体步骤如下：
A.从步骤（1）的球形芽孢杆菌AKU218平板上，挑取一环步骤（1）中制备的球形芽孢杆菌AKU21...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓家国，魏红霞，李国军，
申请(专利权)人：常德云港生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43