内酯水解酶突变体及其应用制造技术

本方案公开了基因工程技术和生物催化领域的一种内酯水解酶突变体，及其作为生物催化剂拆分D,L‑泛解酸内酯制备光学纯D‑泛解酸的应用。所述的内酯水解酶突变体是以来源于拟轮生镰孢菌内酯水解酶作为亲本酶，对氨基酸序列SEQ NO:2中1～14个氨基酸位点进行单突变或组合突变获得；所述的内酯水解酶突变体对D,L‑泛解酸内酯的水解活性相比亲本酶提高了2.3‑128倍。本发明专利技术提供的高活性内酯水解酶可用于生物拆分D,L‑泛解酸内酯制备光学纯D‑泛解酸的规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
内酯水解酶突变体及其应用
本专利技术属于基因工程技术和生物催化领域，尤其涉及一种内酯水解酶突变体及其应用。
技术介绍
D-泛解酸是制造D-泛酸钙、D-泛醇、D-泛硫乙胺的关键手性中间体。D-泛酸钙广泛应用与饲料、医药和食品工业，尤其是作为重要的饲料添加剂，已成为需求量仅次于烟酸的维生素。D-泛醇可作为皮肤用药，防止皮肤感染，并有效治疗皮肤伤口、皮肤擦伤和烫伤。D-泛硫乙胺在医药工业中可用作降血脂药，能降低血清中的总胆固醇、甘油三酯及增高血清中的高密度脂蛋白胆固醇。D-泛解酸的制备方法有化学拆分、物理拆分法和生物酶法拆分。化学拆分技术需使用昂贵的奎尼酸、番木鳖减等拆分试剂，分离工艺复杂，污染问题严重；物理拆分技术的条件苛刻，光学纯度低，收率不高。因而，D-泛解酸化学拆分和物力拆分生产工艺的成本较高，产品质量往往难以保证。生物酶法拆分技术使用高立体选择性的内酯水解酶，反应条件温和，催化剂廉价，环境污染小，分离纯化工艺简便，产品光学纯度高，生产成本低。目前，全球D-泛解酸的生产主要采用生物酶法拆分技术。日本京都大学的SakamotoKeiji等从环境中筛选产D-泛解酸内酯水解酶的微生物菌株，鉴定为Fusariumoxysporum尖孢镰孢菌。该菌株可以高选择性的不对称水解D,L-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，得到D-泛解酸。日本Fuji公司已将次生物酶法拆分技术用于D-泛解酸的工业化生产(USPatent5,275,949,1994；USPatent5,372,940,1994)。国内江南大学的孙志浩教授等从环境中筛选产D-泛解酸内酯水解酶的微生物菌株，鉴定为串珠镰孢霉FusariummoniliformeSW-902(保藏编号为CGMCCNo.0563)。该菌株同样可以高选择性的不对称水解D,L-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，得到D-泛解酸。浙江鑫富生化股份有限公司已将该生物技术用于D-泛解酸的工业化生产，在国内首先实现D-泛解酸的酶法生产(CN1313402A)。以上两种微生物的酶活性虽然达到了工业生产的要求，但在实际生产过程中水解反应时间较长，催化剂用量较大。为了提高内酯水解酶在细胞中的表达量，通过基因工程技术构建重组内酯水解酶基因工程菌是一种有效的方法。日本第一精密化学株式会社通过复杂的基因重组表达设计，将Fusariumoxysporum尖孢镰孢菌的天然内酯水解酶基因克隆到顶头孢霉菌或米曲霉宿主中，构建对应的产内酯水解酶的基因工程菌(WO2004078951)。米曲霉工程菌是胞内表达内酯水解酶，钉头孢霉是分泌表达内酯水解酶到细胞外，但两种产内酯水解酶基因工程菌的酶活提高并不明显，甚至表现比野生型尖孢镰孢菌低的活性。除此之外，以上所涉及产内酯水解酶的微生物均为丝状真菌，菌体呈现多种形态的菌丝状，与呈单细胞的微生物相比，丝状真菌制备成固定化细胞(催化剂)困难，稳定性差。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术通过基因工程技术提供了一系列活性改良的内酯水解酶突变体及其重组基因工程菌。本方案中的内酯水解酶突变体，具体而言，是以来源于拟轮生镰孢菌内酯水解酶(氨基酸序列SEQNO:2)作为亲本酶，通过蛋白质定向进化获得一系列活性改良的内酯水解酶突变体(氨基酸序列SEQNO:4-78，此处的序列编号是偶数)，包含1～14个氨基酸位点的单突变或多点组合突变而获得的内酯水解酶突变体，具体如下：内酯水解酶突变体，它是由氨基酸序列如SEQIDNO:2进行如下任意一种情况的单突变得到：(1)第66位赖氨酸突变为谷氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:56；(2)第147位赖氨酸突变为谷氨酰胺，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:60；(3)第163位天冬氨酸突变为组氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:62；(4)第163位天冬氨酸突变为酪氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:64；(5)第341位酪氨酸突变为丝氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:66；(6)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:68；(7)第260位缬氨酸突变为亮氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:70；(8)第228位甘氨酸突变为缬氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:72；(9)第319位赖氨酸突变为亮氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:74；(10)第352位天冬氨酸突变为苯丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:76；(11)第356位赖氨酸突变为精氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:78。内酯水解酶突变体，它是由氨基酸序列如SEQIDNO:2进行多点组合突变，具体是第66位赖氨酸突变为谷氨酸，且第147位赖氨酸突变为谷氨酰胺，且第172位甘氨酸突变为丝氨酸，且第163位天冬氨酸进行如下任意一种情况的突变得到：(1)第163位天冬氨酸突变为组氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:4；(2)第163位天冬氨酸突变为酪氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:6。进一步，内酯水解酶突变体，由上述突变体氨基酸序列SEQIDNO:6进行如下任意一种情况的突变得到：(1)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:8；(2)第260位缬氨酸突变为亮氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:10；(3)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:12；(4)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:14；(5)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为半胱氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:16；(6)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，且第226位天冬氨酸突变为天冬酰胺，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:18；(7)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，且第226位天冬氨酸突变为丝氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:20；(8)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，且第226位天冬氨酸突变为天冬酰胺，且第141位谷氨酸突变为丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:22；(9)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，且第226位天冬氨酸突变为天冬酰胺，且第141位谷氨酸突变为丙氨酸，且第327位苯丙氨酸突变为酪氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:24；(10)第260位缬氨本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.内酯水解酶突变体，其特征在于：它是由氨基酸序列如SEQ ID NO:2进行如下任意一种情况的单突变得到：/n(1)第66位赖氨酸突变为谷氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:56；/n(2)第147位赖氨酸突变为谷氨酰胺，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:60；/n(3)第163位天冬氨酸突变为组氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:62；/n(4)第163位天冬氨酸突变为酪氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:64；/n(5)第341位酪氨酸突变为丝氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:66；/n(6)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:68；/n(7)第260位缬氨酸突变为亮氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:70；/n(8)第228位甘氨酸突变为缬氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:72；/n(9)第319位赖氨酸突变为亮氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:74；/n(10)第352位天冬氨酸突变为苯丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:76；/n(11)第356位赖氨酸突变为精氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:78。/n...

【技术特征摘要】
1.内酯水解酶突变体，其特征在于：它是由氨基酸序列如SEQIDNO:2进行如下任意一种情况的单突变得到：
(1)第66位赖氨酸突变为谷氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:56；
(2)第147位赖氨酸突变为谷氨酰胺，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:60；
(3)第163位天冬氨酸突变为组氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:62；
(4)第163位天冬氨酸突变为酪氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:64；
(5)第341位酪氨酸突变为丝氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:66；
(6)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:68；
(7)第260位缬氨酸突变为亮氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:70；
(8)第228位甘氨酸突变为缬氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:72；
(9)第319位赖氨酸突变为亮氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:74；
(10)第352位天冬氨酸突变为苯丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:76；
(11)第356位赖氨酸突变为精氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:78。


2.内酯水解酶突变体，其特征在于：它是由氨基酸序列如SEQIDNO:2进行多点组合突变，具体是第66位赖氨酸突变为谷氨酸，且第147位赖氨酸突变为谷氨酰胺，且第172位甘氨酸突变为丝氨酸，且第163位天冬氨酸进行如下任意一种情况的突变得到：
(1)第163位天冬氨酸突变为组氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:4；
(2)第163位天冬氨酸突变为酪氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:6。


3.内酯水解酶突变体，其特征在于：由权利要求2所述突变体氨基酸序列SEQIDNO:6进行如下任意一种情况的突变得到：
(1)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:8；
(2)第260位缬氨酸突变为亮氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:10；
(3)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:12；
(4)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:14；
(5)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为半胱氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:16；
(6)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，且第226位天冬氨酸突变为天冬酰胺，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:18；
(7)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，且第226位天冬氨酸突变为丝氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:20；
(8)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，且第226位天冬氨酸突变为天冬酰胺，且第141位谷氨酸突变为丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:22；
(9)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，且第226位天冬氨酸突变为天冬酰胺，且第141位谷氨酸突变为丙氨酸，且第327位苯丙氨酸突变为酪氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQIDNO:24；
(10)第260位缬氨酸突变为丙氨酸，且第88位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，且第341位酪氨酸突变为丝氨酸，且第226位天冬氨酸突变为天...

【专利技术属性】
技术研发人员：万南微，陈永正，张秋华，周中平，
申请(专利权)人：江西兄弟医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36