天冬氨酸酶突变体及其工程菌的合成与应用制造技术

本方案公开了基因工程技术和生物催化领域的一种天冬氨酸酶突变体，及其作为生物催化剂催化丙烯酸制备β

【技术实现步骤摘要】
天冬氨酸酶突变体及其工程菌的合成与应用


[0001]本专利技术属于基因工程技术和生物催化领域，特别涉及一种天冬氨酸酶突变体及其工程菌的合成与应用。

技术介绍

[0002]β
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丙氨酸(β
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alanine)，又名3
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氨基丙酸，是自然界中唯一存在的β型氨基酸。β
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丙氨酸是一种非蛋白质氨基酸，与蛋白质氨基酸α
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丙氨酸互为同分异构体。β
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丙氨酸可以在微生物、植物和昆虫体内合成，而哺乳动物需从外界环境中摄取。β
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丙氨酸可用于合成泛醇、辅酶A、肌肽和鹅肌肽等多种高附加值产品，在生物体内具有许多重要的生理作用。因而，β
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丙氨酸在医药、食品、化工和环境等领域具有广泛的应用价值。首先，β
‑
丙氨酸作为一种营养因子，被广泛用作运动营养补充剂或食品添加剂。澳大利亚体育学院的膳食补充剂分类系统根据对运动表现有益的证据水平将β
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丙氨酸描述为A类补充剂，已被确定为肌肽(β
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丙氨酰
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L
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组氨酸)合成的限速前体，并一直被证明能增加人类骨骼肌肌肽的水平。此外，工业上很多重要化合物如聚β
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丙氨酸、3
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羟基丙酸、聚3
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羟基丙酸酯和药物巴柳氮等都是以β
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丙氨酸为重要前体或中间体制备的。β
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丙氨酸系列产品的全球需求量约为6万吨，且需求量仍在不断增加，预计到2025年全球市场需求可达10万吨，被认为是未来全球12种最具开发潜力的三碳化工产品之一。
[0003]目前，合成β
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丙氨酸的方法可分为化学法和生物法。化学法是以丙烯腈为原料，通过液氨胺化得到β
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氨基丙腈中间体，该反应在100
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109℃，1Mpa压力的反应条件下进行；β
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氨基丙腈进一步通过氢氧化钠碱解生产β
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丙氨酸钠，再经盐酸中和获得β
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丙氨酸，该步反应在90
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95℃反应条件下进行，生产1吨β
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丙氨酸需2吨氢氧化钠和2吨盐酸。β
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丙氨酸化学法合成工艺设计高温、高压，能耗高，副产物多，且产生的三废较多。生物法合成β
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丙氨酸包括生物发酵法和生物催化法。Sang Yup Lee等人通过对大肠杆菌的代谢工程改造，β
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丙氨酸产量达到32g/L(Metabolic Engineering,2015,30,121
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129)。此后，有一系列可用于发酵产生β
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丙氨酸的工程菌株的报道。然而，微生物发酵法工业化生产β
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丙氨酸仍然面临着效价和生产率适中、发酵成本过高和操作复杂等挑战，目前还较难实现产业化应用。
[0004]生物催化法合成β
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丙氨酸可根据工艺路线或所使用的酶催化剂的差异分划分为两种。一种生物催化工艺路线是以富马酸为原料，通过天冬氨酸酶和L
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天冬氨酸
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α
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脱羧酶催化的胺化
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脱羧生物级联反应制备β
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丙氨酸，该工艺原子经济性差，涉及两步酶催化，所使用的生物酶量大，且反应过程和操作相对较复杂。另一种生物催化工艺路线是以丙烯酸为原料，通过酶催化的直接胺化反应制备β
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丙氨酸(CN 109385415，CN 110923272)。该技术路线反应步骤短，操作简单，原子经济性高，具有较大的技术优势。然而，天然的天冬氨酸酶具有较高的底物特异性，只能催化天然底物富马酸进行氨化反应，需通过蛋白质工程技术对天冬氨酸酶进行分子改造，来获得可催化非天然丙烯酸类化合物进行氨化反应的突变体酶(ChemCatChem,2014,6,965
‑
968；Nature Chemical Biology，2018，14,664
–
670)。

技术实现思路

[0005]本专利技术通过基因工程技术提供了一系列可用于催化丙烯酸制备β
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丙氨酸的天冬氨酸酶突变体及其重组基因工程菌。
[0006]本方案中的天冬氨酸酶突变体，具体而言，是以来源于Lysinibacillus halotolerans菌株的野生型天冬氨酸酶(氨基酸序列SEQ NO:2，NCBI登录号：WP_122971212.1)作为亲本酶，通过蛋白质定向进化获得一系列活性改良的天冬氨酸酶突变体，由氨基酸序列SEQ ID NO:2中4
‑
6个氨基酸位点组合突变而获得的天冬氨酸酶突变体(氨基酸序列SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:10，此处的序列编号是偶数；基因序列SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:9，此处的序列编号是奇数)，具体如下：
[0007]天冬氨酸酶突变体，它是由SEQ ID NO:2氨基酸序列进行如下任意一种情况的组合突变得到：
[0008](1)第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，得到天冬氨酸突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:4；
[0009](2)第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，且第105位异亮氨酸突变为缬氨酸，得到天冬氨酸突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:6；
[0010](3)第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，且第357位谷胺酰氨突变为组氨酸，得到天冬氨酸突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:8；
[0011](4)第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，第105位异亮氨酸突变为缬氨酸，且第357位谷胺酰氨突变为组氨酸，得到天冬氨酸突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:10。
[0012]本专利技术还提供了以上任意一种天冬氨酸酶突变体的重组基因工程菌。所述天冬氨酸酶基因工程菌所采用的宿主细胞为大肠杆菌，优选为E.coli BL21(DE3)；对应表达天冬氨酸酶的载体可以是pET
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21a(+)，pET
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22a(+)，pET
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22a(+)，pET
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28a(+)，pETDuet
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1，优选为pET
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28a(+)载体；但不仅限于所述的大肠杆菌宿主和表达载体。
[0013]进一步，大肠杆菌发酵产天冬氨酸酶基因工本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.天冬氨酸酶突变体，其特征在于：所述天冬氨酸突变体由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列突变而得到的如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10中的任一种所示的天冬氨酸突变体氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于：所述的天冬氨酸突变体氨基酸序列SEQ ID NO:4由SEQ ID NO:2中的第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸而得。3.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于：所述的天冬氨酸突变体氨基酸序列SEQ ID NO:6由SEQ ID NO:2中的第189位苏氨酸突变为亮氨酸，第323位甲硫氨酸突变为亮氨酸，第326位赖氨酸突变为甲硫氨酸，第328位天冬酰胺突变为半胱氨酸，第105位异亮氨酸突变为缬氨酸而得。4.根据权利要求1所述的天冬氨酸酶突变体，其特征在于：所述的天冬氨酸突变体氨基酸序列SEQ ID NO:8由S...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秋华，万南微，陈永正，周中平，黄刘女，
申请(专利权)人：江西兄弟医药有限公司，
类型：发明
国别省市：