一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法：(1)悬浮神经球贴壁培养；(2)神经干细胞灭活；(3)CFSE标记hPBMC；(4)共培养；(5)淋巴细胞亚群及增殖检测；(6)细胞因子检测；(7)数据处理；(8)结果分析。本发明专利技术利用hPBMC，体外模拟人体免疫反应，研究不同来源、不同代次、不同培养方式等神经干细胞的免疫调节作用，从而对神经干细胞的工艺开发提供依据。本发明专利技术将悬浮培养的神经球消化成单细胞，然后贴壁，有利于对其进行数量控制和灭活，利用CFSE随细胞分裂在子代中平均分配的特性，结合不同淋巴细胞亚群抗体，可用流式细胞仪直观地检测特定细胞亚群地增殖情况。将各检测指标进行组合，减少操作步骤，节约实验材料，降低成本。

【技术实现步骤摘要】
一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法
本专利技术涉及一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，属于干细胞技术研究和免疫学领域。
技术介绍
神经干细胞(neuralstemcell，NSC)是指存在于神经系统中，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，从而能够产生大量脑细胞组织，并能进行自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群。神经干细胞技术近年来发展迅速，其在中枢神经损伤疾病等方面有着巨大的临床应用潜力。不仅如此，神经干细胞治疗的优势明显，比如安全、治疗材料来源充足、治疗疾病范围广阔等，许多国家都将其作为重要的研究发展方向之一。神经干细胞疗法治疗疾病主要有以下作用机制：1、患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。2、缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位。3、神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复。4、神经干细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)悬浮神经球贴壁培养：用人层粘连蛋白包被孔板，备用；收集悬浮培养的神经干细胞球，离心，弃上清，加入accutase消化酶消化，加入生理盐水稀释消化液，离心，弃上清，取神经干细胞用NSC培养基重悬接种至包被好的孔板，培养；/n(2)神经干细胞灭活：向上述贴壁培养的神经干细胞中加入丝裂霉素C，孵育；弃去培养基，加入PBS缓冲液清洗2次，备用；/n(3)CFSE标记hPBMC：向hPBMC中加入荧光染料SFSE工作液，快速重悬混匀，室温避光孵育进行CFSE标记；加入培养基终止标记，离心，弃上清，加入生理盐水洗涤细胞一次；/n...

【技术特征摘要】
1.一种神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)悬浮神经球贴壁培养：用人层粘连蛋白包被孔板，备用；收集悬浮培养的神经干细胞球，离心，弃上清，加入accutase消化酶消化，加入生理盐水稀释消化液，离心，弃上清，取神经干细胞用NSC培养基重悬接种至包被好的孔板，培养；
(2)神经干细胞灭活：向上述贴壁培养的神经干细胞中加入丝裂霉素C，孵育；弃去培养基，加入PBS缓冲液清洗2次，备用；
(3)CFSE标记hPBMC：向hPBMC中加入荧光染料SFSE工作液，快速重悬混匀，室温避光孵育进行CFSE标记；加入培养基终止标记，离心，弃上清，加入生理盐水洗涤细胞一次；
(4)共培养：将步骤(3)CFSE标记后的hPBMC用培养基重悬，然后接种至步骤(2)灭活的神经干细胞中，加入PHA和IL-2，进行共培养，至培养终点，加入细胞激活剂孵育；同时设立无NSC孔作为对照组；
(5)淋巴细胞亚群及增殖检测：共培养组和对照组的悬浮细胞，按检测流式抗体组合和同型流式抗体组合分别标记细胞，流式细胞术检测不同细胞亚群比例及不同细胞亚群中CFSE的表达情况；
(6)细胞因子检测：根据免疫调节考察指标，检测培养上清中因子表达情况；
(7)数据处理：用modfit软件对各亚群的CFSE分裂代次进行分析，获得增殖指数，增殖指数越高说明增殖越明显；
(8)结果分析：比较共培养组和对照组不同指标表达差异，判断神经干细胞的免疫调节作用。


2.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，人层粘连蛋白的终浓度为10μg/ml；
或/和：所述步骤(1)中，孔板为24孔板、48孔板或96孔板；
或/和：所述步骤(1)中，孔板的包被时间为2～24小时；
或/和：所述步骤(1)中，消化的条件为：37℃消化13～15分钟；
或/和：所述步骤(1)中，NSC贴壁培养的条件为：37℃，5.0％CO2，培养6～16小时。


3.根据权利要求1或2所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)具体为：用终浓度为10μg/ml的人层粘连蛋白包被24孔板或48孔板或96孔板，包被时间2～24小时，备用；收集悬浮培养的神经干细胞球于50ml离心管中，500g离心5分钟，弃上清，加入1mlaccutase消化酶，37℃消化13～15分钟，加入20ml生理盐水稀释消化液，500g离心5分钟，弃上清，取消化好的神经干细胞，用NSC培养基重悬接种至以上包被好的孔板，37℃，5.0％CO2培养箱中培养6～16小时。


4.根据权利要求1所述的神经干细胞免疫调节功能的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，丝裂霉素C的终浓度为10～30μg/ml；
或/和：所述步骤(2)中，孵育的条件为：37℃，5.0％CO2，孵育1小时。

【专利技术属性】
技术研发人员：和会娟，杨印祥，杨敏，董白翔，
申请(专利权)人：北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11