一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测M型磷脂酶A2受体‑IgG的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法，属于免疫检测分析技术和纳米生物技术领域，在所述试剂盒中，包括集成在试剂条上的反应缓冲液、清洗液、增强液、包被PLA2R的磁微粒溶液、铕标记的羊抗人IgG抗体溶液，另附2瓶抗PLA2R IgG的冻干校准品。上述试剂盒可以提供一种接近均相的反应体系，检测抗PLA2R IgG的含量，缩短检测时间，提高了效率，为临床使用提供便利。

【技术实现步骤摘要】
一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
本专利技术属于免疫检测分析技术和纳米生物
，具体涉及一种基于M型磷脂酶A2受体(PLA2R)-IgG时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
在我国成年人中肾脏病的患病率达到10.8％，其肾脏病理改变以肾小球基膜通透性增加为主，主要临床症状表现为尿液中大量蛋白尿、血清中白蛋白下降、血脂升高以及高度水肿。其中膜性肾病(membranousnephropathy，MN)是引起成人肾病综合征的一个最常见的病因之一，根据病因不同主要分为特发性膜性肾病(idiopathicmembranousnephropathy，IMN)、继发性膜性肾病(secondmembranousnephropathy，SMN)。IMN约占膜性肾病的三分之二；SMN约占膜性肾病的三分之一，常见的致病因素有自身免疫性疾病、病毒感染、肿瘤及药物等；目前膜性肾病诊断上要依靠临床表现及肾活检病理改变，但是其缺点也很明显，如：具有创伤，原有肾感染在穿刺后细菌扩散所致的穿刺术后感染；另外肾穿刺的费用很高，对病人来说是个痛苦、有风险、经济负担重的过程。如果能有其他医学手段，特别是血清学检查手段能对膜性肾病进行灵敏、准确地诊断和疗效评估，将是该疾病诊治的一个突破。2009年Beck等在《新英格兰医学杂志》撰文首次发现存在于正常足细胞表面的膜性肾病的靶抗原-M型磷脂酶A2受体(PLA2R)，对膜性肾病的发病机制研究中取得了突破性进展。2011年，Qin等试验表明抗PLA2R抗体在IMN中具有高特异性(89％)。Hofstra等研究发现在抗PLA2R抗体表达转阴或滴度下降的IMN患者中，蛋白尿的缓解率或部分缓解率达88％，而在抗PLA2R抗体未转阴或滴度未下降的患者中，蛋白尿的缓解率或部分缓解率仅有33％，且对于治疗前后抗PLA2R抗体浓度持续高水平表达的患者，病情不易得到缓解或缓解后较易复发。毫无疑问，PLA2R-IgG的发现及检测不仅对膜性肾病的诊断、活动性的判断是一个理想的标志物，在膜性肾病的诊治疗时机的把握、有效药物的选择以及治疗效果的判也提供了一个重要的指标，越来越的研究证实了PLA2R-IgG的发现及检测对膜性肾病的诊断和治上的重要临床应用价值。采用时间分辨荧光免疫分析(time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)进行PLA2R-IgG的检测。TRFIA是一种以镧系元素螯合物为标记物的新兴技术，具有零本底、线性范围宽、稳定性好等特点，灵敏度可达到10-18mol/L，较ELISA、CLIA、ECLIA等的10-9～10-15mol/L更高，TRFIA的主要创新内容在于应用荧光强度大、衰变时间长、分子量小的镧系原子标记免疫分子，而不是常用的大分子的酶或放射性同位素，故建立的免疫方法灵敏度和量程成倍增加，而且没有放射性污染。时间分辨荧光免疫分析技术标记离子的荧光是类线光谱，其特点是激发光波长范围较宽而发射光谱峰范围较窄，这样有利于降低本底的荧光强度，提高检测的分辨率；在时间分辨荧光免疫分的激发光和发射光之间存在较大的Stokes位移，这有利于排除非特异荧光的干扰，从而增强了测量的特异性；标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，这有利于消除样品及环境中非特异荧光物质对检测结果的影响；每一次检测都要重复进行1000次，取平均的荧光计数值作为结果，从而提高了检测的准确性。TRFIA是国内外免疫分析的主要发展方向之一。
技术实现思路
针对现有技术中存在的缺陷，本专利通过将TRFIA与磁微粒技术相结合，将所有试剂集成在一个试剂条上，建立PLA2R-IgG-TRFIA方法，该检测可由全自动设备操作，准确的高，单人份检测，使用方便，将此技术应用于膜性肾病的研究，可以更准确的鉴别诊断特发性膜性肾病、继发性膜性肾病，以通过方便的血清学检查进行膜性肾病的疗效评估。为膜性肾病的诊断和治疗提供一个非常便捷的新手段。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：1.一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括至少一个试剂架，每个所述的试剂架上包括至少五个试剂条，所述试剂盒内还包括至少二瓶抗PLA2R-IgG的冻干校准品；所述试剂条上包括磁珠孔、反应缓冲液孔、铕标冻干孔、检测孔、清洗液孔、增强液孔和若干个预留孔；所述磁珠孔内填充包被PLA2R抗原的磁微粒溶液，所述反应缓冲液孔内填充反应缓冲液，所述铕标冻干孔内填充铕标记的羊抗人IgG抗体溶液，所述检测孔内填充待检样品，所述清洗液孔内填充清洗液，所述增强液孔内填充增强液。进一步的，所述试剂盒内包括5～20个试剂架，每个所述的试剂架上设有5个试剂条；所述试剂盒内还包括2瓶抗PLA2R-IgG的冻干校准品。进一步的，所述包被PLA2R抗原的磁微粒溶液经直径为50～5000纳米的活化的磁微粒与羊抗人IgG抗体溶液连接、洗涤、封闭制备得到；所述铕标记的羊抗人IgG抗体溶液溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记羊抗人IgG抗体溶液制备得到。进一步的，所述反应缓冲液为pH7.8的50mmol/LTris-HCl含8mmol/LNaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/LTween-80和0.1％NaN3；所述清洗液为含0.48g/L的Tris、12.49g/L的NaCl、1.11g/L的Tween-20，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；所述增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸、0.5g/L的醋酸钠、0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮、0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液；所述抗PLA2R-IgG的冻干校准品为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-HCl的反应缓冲液，将抗PLA2R-IgG配制成不同浓度的校准品溶液。一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下内容：抗PLA2R-IgG校准品溶液的制备：取高浓度抗PLA2R-IgG溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-HCl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装，2～8℃保存；包被PLA2R抗原的磁微粒溶液的制备：取直径为50～5000nm的四氧化三铁微球用质量浓度为0.5～2％的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为5.0的MES缓冲液清洗1～3次，然后用上述缓冲溶液进行悬浮，制成浓度为100mg/mL的磁微粒悬浮液；取100μL所述磁微粒悬浮液，然后加入1mL的0.05mol/L的pH为5.0的MES缓冲液和50μg的羊抗人IgG抗体溶液，于25℃混匀温育2小时，然后进行磁性分离，保留磁微粒，用pH为7.2的5％BSA和0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括至少一个试剂架，每个所述的试剂架上包括至少五个试剂条，所述试剂盒内还包括至少二瓶抗PLA2R-IgG的冻干校准品；所述试剂条上包括磁珠孔、反应缓冲液孔、铕标冻干孔、检测孔、清洗液孔、增强液孔和若干个预留孔；所述磁珠孔内填充包被PLA2R抗原的磁微粒溶液，所述反应缓冲液孔内填充反应缓冲液，所述铕标冻干孔内填充铕标记的羊抗人IgG抗体溶液，所述检测孔内填充待检样品，所述清洗液孔内填充清洗液，所述增强液孔内填充增强液。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括至少一个试剂架，每个所述的试剂架上包括至少五个试剂条，所述试剂盒内还包括至少二瓶抗PLA2R-IgG的冻干校准品；所述试剂条上包括磁珠孔、反应缓冲液孔、铕标冻干孔、检测孔、清洗液孔、增强液孔和若干个预留孔；所述磁珠孔内填充包被PLA2R抗原的磁微粒溶液，所述反应缓冲液孔内填充反应缓冲液，所述铕标冻干孔内填充铕标记的羊抗人IgG抗体溶液，所述检测孔内填充待检样品，所述清洗液孔内填充清洗液，所述增强液孔内填充增强液。


2.如权利要求1所述的一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内包括5～20个试剂架，每个所述的试剂架上设有5个试剂条；所述试剂盒内还包括2瓶抗PLA2R-IgG的冻干校准品。


3.如权利要求1所述的一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述包被PLA2R抗原的磁微粒溶液经直径为50～5000纳米的活化的磁微粒与羊抗人IgG抗体溶液连接、洗涤、封闭制备得到；
所述铕标记的羊抗人IgG抗体溶液溶液以Eu3+-N2-[P-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸钠标记羊抗人IgG抗体溶液制备得到。


4.如权利要求1所述的一种检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒，其特征在于：所述反应缓冲液为pH7.8的50mmol/LTris-HCl含8mmol/LNaCl、0.1％BSA、50μmol/LDTPA、0.1ml/LTween-80和0.1％NaN3；
所述清洗液为含0.48g/L的Tris、12.49g/L的NaCl、1.11g/L的Tween-20，以盐酸调节pH为7.8的缓冲溶液；
所述增强液为含体积浓度为3.6‰的冰醋酸、0.5g/L的醋酸钠、0.05g/L的β-萘甲酰三氟丙酮、0.03g/L的三辛基氧化膦和体积浓度为1‰的TritonX-100的混合溶液；
所述抗PLA2R-IgG的冻干校准品为用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH7.8Tris-HCl的反应缓冲液，将抗PLA2R-IgG配制成不同浓度的校准品溶液。


5.一种如权利要求1至4中任意一项所述的检测M型磷脂酶A2受体-IgG的免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下内容：
抗PLA2R-IgG校准品溶液的制备：取高浓度抗PLA2R-IgG溶液用含2g/L的BSA和1g/L的NaN3的50mmol/L的pH为7.8的Tris-HCl反应缓冲液配制成不同浓度的校准品溶液，进行分装，2～8℃保存；
包被PLA2R抗原的磁微粒溶液的制备：取直径为50～5000nm的四氧化三铁微球用质量浓度为0.5～2％的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化，室温混匀4小时后，用0.05mol/L的pH为5.0的MES缓冲液清洗1～3次，然后用上述...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄飚，任志奇，静亚茹，
申请(专利权)人：浙江博实生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33