一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒及其制备和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒及其制备方法和应用，所述试剂盒包括R1试剂、R3试剂；或所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂，其中，所述R1试剂为含有偶联单克隆抗体的磁微粒缓冲液；所述R2试剂为含蛋白保护剂的缓冲液；所述R3试剂为一种含有吖啶酯标记单克隆抗体的结合物的缓冲液；所述试剂盒还包括校准品及激发液A和激发液B。本发明专利技术所述的检测试剂盒具有灵敏度高、操作简单、特异性强、无污染且适用于临床，可快速高效进行高通量检测等的优点，为临床人血清Cyr61蛋白的检测提供了有效工具，对冠心病患者支架植入的风险预测具有指导意义，便于临床辅助诊断应用；也为相关的临床研究提供技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒及其制备和应用
本专利技术属于生物检测领域，具体利用双单克隆抗体夹心法的原理开发了一种检测人血清中Cyr61蛋白的含量的检测试剂盒，以预测心脏支架植入术后的潜在风险，对心脑血管疾病患者的临床辅助诊断提供一定的帮助。
技术介绍
富含半胱氨酸蛋白61(CCN1)也称为CCN1，是由即刻早期基因(IEG)编码的肝素结合蛋白。CCN1是CCN家族第一个被认定为CCN1到CCN6的成员。作为分泌的细胞外基质(ECM)蛋白，CCN1参与胚胎发育，伤口愈合和组织重塑，血管生成和成骨细胞分化等。此外，体内CCN1含量的增加与人类许多疾病有关。在恶性肿瘤(例如乳腺癌，食管鳞状细胞癌，肺癌等)中，CCN1表达有所改变。CCN1作为已知的主要促血管生成因子，近来又被定义为一种新型的促炎因子，它与动脉粥样硬化斑块破裂导致的血栓形成进而发生急性心肌梗塞(acutemyocardialinfarction，AMI)之间有一定的关联。经皮冠状动脉介入(percutaneouscoronaryintervention，PCI)及支架治疗已成为心血管疾病患者血供重建的最常用且有效的方法，可以使狭窄及闭塞血管再通，达到血运重建，快速有效缓解缺血症状，但PCI同样带来一定的风险，包括支架内血栓形成(ST)和支架内再狭窄(ISR)。早期支架内血栓发生在支架植入30天内，迟发支架内血栓发生在支架植入30天后，且早期支架内血栓形成较迟发支架内血栓形成更为常见。另外，PCI术后血管壁损伤可引起相关炎症反应，促使成纤维母细胞和平滑肌细胞增生，从而发生支架内再狭窄。然而支架内再狭窄的发生对PCI术后长期预后影响极大。目前研究发现，支架内血栓形成的发生率1年内<1％，随后每年的发生率约为0.2％～0.4％。支架内再狭窄的发生率约为5％。因此，支架植入的术后风险预测对病人术后治疗和疾病转归具有重要意义，但目前仍无有效的支架植入风险预测标志物。研究显示，支架植入前后血清中富含半胱氨酸蛋白61(Cyr61)的水平与术后恢复状态显著相关，故Cyr61可能是支架植入风险预测的有效生物标志物。鉴于此，临床上对于应用CCN1检测需求越来越高。目前尚无可供临床使用的商品化Cyr61蛋白检测试剂盒，仅有供科研使用的ELISA检测试剂盒，且样本需要前处理，操作繁琐，耗时耗力，灵敏度有限，在诊断的特异性和敏感性方面均存在不足，不合适进行高通量的临床检测。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术旨在开发一种自动化程度高，样本无需处理，需时短且灵敏度高，适用于临床应用的化学发光检测试剂盒，旨在实现对血清中Cyr61准确、可靠、高灵敏的检测。本专利技术提供了一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，包括R1试剂、R3试剂；或，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂。其中，所述R1试剂为含有偶联单克隆抗体的磁微粒缓冲液。“偶联单克隆抗体”具体指一种利用单克隆抗体的属性将抗体偶联到磁微粒上羧基的技术。所述R1试剂的工作浓度为：0.3-1.0mg/mL；优选地，为0.5mg/mL。所述R1试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，0.01-0.3％(v/v)RPE1740的磷酸盐缓冲液，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4，所述磷酸盐的浓度为20-100mM；优选地，为1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)RPE1740的磷酸盐缓冲液，浓度为0.1％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.3，所述磷酸盐的浓度为50mM。其中，所述R2试剂为含蛋白保护剂的缓冲液。所述R2试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，0.01-0.3％(v/v)Tween-20或TritonX-100，浓度为20-100mM的磷酸盐(或Tris)，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4；优选地，为1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)Tween-20，浓度为50mM的磷酸盐(或Tris)，浓度为0.1％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.3。所述蛋白保护剂是指缓冲液中含有的蛋白及表面活性剂。其中，所述R3试剂为含有吖啶酯标记单克隆抗体的结合物的缓冲液。“单克隆抗体”具体指Cyr61单克隆抗体。所述吖啶酯作为标记物。所述R3试剂的工作浓度为：0.05-0.5ug/mL；优选地，为0.1ug/mL。所述R3试剂中缓冲液的组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，0.01-0.3％(v/v)Tween-20或TritonX-100，浓度为20-100mM的磷酸盐(或Tris)，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4；优选地，为含有1％(w/v)BSA，0.1％(v/v)Tween-20，浓度为50mM的磷酸盐，浓度为0.1％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.3。进一步地，所述试剂盒的制备开发过程中还包括激发液A和激发液B，即，所述激发液A和激发液B可以是所述试剂盒中的组成部分，也可以与试剂盒配套使用。其中，所述激发液A含有0.05-0.15M硝酸和1-1.5g/100mL过氧化氢；优选地，为含有0.1M硝酸和1.5g/100mL过氧化氢。其中，所述激发液B含有0.5-2.5g/100mL氢氧化钠和0.1-0.3g/100mLTritonX-100；优选地，为含有1.5g/100mL氢氧化钠和0.2g/100mLTritonX-100。进一步地，所述试剂盒的制备开发过程中还包括校准品，即，所述校准品可以是所述试剂盒中的组成部分，也可以与试剂盒配套使用。所述校准品为含有Cyr61蛋白的缓冲液。(1)所述缓冲液组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，浓度为20-100mM的磷酸盐(或Tris)缓冲液，其余为去离子水，pH值范围为7.2～7.4；优选地，为1％(w/v)BSA，浓度为50mM的磷酸盐(或Tris)缓冲液，其余为去离子水，pH值范围为7.3。(2)所述校准品的浓度为0-3000pg/ml；优选地，为0.00，31.25，62.50，125，500，1000，3000pg/ml。本专利技术所述试剂盒中包含R1试剂、R3试剂的反应为一步法反应，R1、R3试剂和样品加一起先进行孵育，然后进行清洗，最后加入激发液A、B发光，读数。本专利技术所述试剂盒中包含R1试剂、R2试剂、R3试剂的反应为两步法反应，即，R1、R2试剂和样品加一起先进行孵育，然后进行清洗，然后加入R3试剂进行孵育，再次清洗，之后加入激发液A、B发光，读数。本专利技术还提供了一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒的制备方法：(1)配制R1试剂：a.按照上述R1试剂中缓冲液的组分配制缓冲液，调节pH；b.制备有包被Cyr61单克隆抗体的磁微粒：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括R1试剂、R3试剂；或，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂；其中，所述R1试剂为含有偶联单克隆抗体的磁微粒缓冲液；所述R2试剂为含蛋白保护剂的缓冲液；所述R3试剂为一种含有吖啶酯标记单克隆抗体的结合物的缓冲液。/n

【技术特征摘要】
1.一种富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括R1试剂、R3试剂；或，所述试剂盒包括R1试剂、R2试剂、R3试剂；其中，所述R1试剂为含有偶联单克隆抗体的磁微粒缓冲液；所述R2试剂为含蛋白保护剂的缓冲液；所述R3试剂为一种含有吖啶酯标记单克隆抗体的结合物的缓冲液。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R1试剂的工作浓度为：0.3-1.0mg/mL；和/或，所述R1试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，0.01-0.3％(v/v)RPE1740的磷酸盐缓冲液，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4，所述磷酸盐的浓度为20-100mM。


3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，0.01-0.3％(v/v)Tween-20，浓度为20-100mM的磷酸盐，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4；和/或，所述R3试剂的工作浓度为：0.05-0.5ug/mL；和/或，所述R3试剂中的缓冲液的组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，0.01-0.3％(v/v)Tween-20或TritonX-100，浓度为20-100mM的磷酸盐，浓度为0.05-0.2％的叠氮钠，其余为去离子水，pH值为7.2～7.4。


4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括激发液A和激发液B；其中，所述激发液A含有0.05-0.15M硝酸和1-1.5g/100mL过氧化氢；所述激发液B含有0.5-2.5g/100mL氢氧化钠和0.1-0.3g/100mLTritonX-100。


5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括含有Cyr61蛋白的缓冲液校准品；其中，所述校准品中的缓冲液组成为：0.1-1.0％(w/v)BSA，浓度为20-100mM的磷酸盐或Tris缓冲液，其余为去离子水，pH值范围为7.2～7.4；和/或，所述校准品的浓度为0-3000pg/ml。


6.如权利要求1-3之任一项所述富含半胱氨酸蛋白61高敏化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制R1试剂：
a.按照如权利要求2所述的R1试剂中缓冲液组分配制缓冲液，调节pH；
b.制备有包被Cyr61单克隆抗体的磁微粒：
(b-1)将Cyr61单克隆抗体进行透析；
(b-2)向磁微粒中加入EDC和NHS，进行第一次滚轴，然后加入所述步骤(b-1)透析后的单克隆抗体和MES，进行第二次滚轴，得到包被有Cyr61单克隆抗体的磁微粒；
c.将所述包被有Cyr61单克隆抗体的磁微粒用步骤a配制的缓冲液进行1:10-1:20稀释，所得溶液即为R1试剂；
(2)配制R2试剂：
按照如权利要求3所述R2试剂中缓冲液的组分配制缓冲液，调节pH，所得溶液即为R2试剂；
(3)配制R3试剂：
a.按照如权利要求3所述R3试剂中缓冲液组分配制缓冲液，调节pH；
b.制备有标记吖啶酯的Cyr61单克隆抗体：
(b-1)将Cyr61单克隆抗体透析，加入吖啶酯，反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘锋，张艳，张杰，邹艳芳，樊桦，
申请(专利权)人：德赛诊断系统上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31