一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用，所述方法包括如下步骤：裂解、转化、结合、漂洗、干燥和洗脱。本发明专利技术在血浆被裂解处理后就开始游离DNA的转化的过程，省略了传统游离DNA提取时结合与洗脱的步骤，减少样本损失；同时，游离DNA的提取和转化过程在同一个离心管内进行，进一步减少了样本转管时造成的损失。本发明专利技术还省略了传统DNA转化过程中的脱磺基步骤，转而由PCR检测时程序中的预变性步骤来代替，相比于传统方法更加简便、高效、降低成本并利于自动化操作，增加了血浆游离DNA甲基化检测的起始样本量，使检测敏感性进一步增加。

【技术实现步骤摘要】
一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用。
技术介绍
近年来以甲基化分析为代表的表观遗传学和表观基因组学研究较为活跃，尤其是对肿瘤抑制基因启动子CpG位点的DNA异常高甲基化研究已经成为热点。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶的催化下，将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到CpG位点的5＇胞嘧啶上，生成5-甲基胞嘧啶的过程。人类基因启动子区含有大量的CpG位点，当这些CpG位点发生异常高甲基化时，该基因的转录和表达就会受到抑制，最终引起疾病的发生。当含有异常高甲基化DNA的细胞死亡时，DNA进入血液循环系统。因此，以血液为样本检测异常DNA甲基化对于早期癌症的检测具有重要意义。为了区分和检测正常样本和癌症样本中的甲基化序列，人们设计了多种方法。第一代方法主要是使用甲基化敏感限制性内切酶处理样本，然后进行southern印记杂交。第二代方法包括专注于发现正常组织和癌组织中不同的甲基化区域或分析肿瘤抑制基因甲基化特征的方法。这些技术大致可分为：1)CpG位点检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，包括以下步骤：/n1)裂解：向血浆中加入蛋白酶K和裂解缓冲液进行裂解，所述裂解缓冲液为SDS、EDTA和Tris-HCl的混合液；/n2)转化：向步骤1)产物加入转化混合液，进行转化，所述转化混合液为氢氧化钠、对苯二酚和亚硫酸氢钠的混合液；/n3)结合：向步骤2)混合液加入结合液及磁珠，室温静置后进行磁分离，所述结合液为盐酸胍、柠檬酸及异丙醇的混合液；/n4)漂洗：将得到的磁珠用漂洗液进行漂洗；/n5)干燥洗脱：漂洗后的磁珠经干燥后加入洗脱液，室温静置后进行磁分离，洗脱后的上清液为提取转化后的游离DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，包括以下步骤：
1)裂解：向血浆中加入蛋白酶K和裂解缓冲液进行裂解，所述裂解缓冲液为SDS、EDTA和Tris-HCl的混合液；
2)转化：向步骤1)产物加入转化混合液，进行转化，所述转化混合液为氢氧化钠、对苯二酚和亚硫酸氢钠的混合液；
3)结合：向步骤2)混合液加入结合液及磁珠，室温静置后进行磁分离，所述结合液为盐酸胍、柠檬酸及异丙醇的混合液；
4)漂洗：将得到的磁珠用漂洗液进行漂洗；
5)干燥洗脱：漂洗后的磁珠经干燥后加入洗脱液，室温静置后进行磁分离，洗脱后的上清液为提取转化后的游离DNA。


2.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤1)所述血浆与所述裂解缓冲液的体积比为1:0.1-0.4；所述SDS在裂解缓冲液中的质量百分比浓度为1-5％，所述EDTA在裂解缓冲液中的摩尔浓度为10-100mM，所述Tris-HCl在裂解缓冲液中的摩尔浓度为50-150mM；所述血浆与蛋白酶K的体积比为5-15:1，所述蛋白酶K的浓度5-20mg/ml。


3.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤1)所述裂解的温度为50-70℃；所述裂解时间为10-30min。


4.根据权利要求1所述的一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法，其特征在于，步骤2)所述转化混合液加入体积与步骤1)所得裂解产物的体积比为1：3-5；所述氢氧化钠在转化混合液中的摩尔浓度为50-100mM，所述对苯二酚在转化混合液中的摩尔浓度为0.5-2mM，所述亚硫酸氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵辉，陈晨，
申请(专利权)人：昂凯生命科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32