一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术涉及一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法，依据实验过程将相关试剂预混后形成预混试剂装入试剂盒，能够有效的简化实验操作步骤，同时通过对预混试剂组分进行针对性调整实现试剂在冷藏条件下的长期有效保存，避免实验使用试剂盒时需要反复冻融的繁琐操作，使实验流程显著简化。

【技术实现步骤摘要】
一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法
本专利技术涉及基因检测文库制备
，尤其涉及一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法。
技术介绍
高通量测序技术(High-throughputSequencing)是一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，又称下一代测序技术(Next-GenerationSequencing)、二代测序技术，其使得可对一个物种的基因组和转录组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序(DeepSequencing)。现有用于高通量测序的试剂盒均着眼于实验基本原理，试剂盒除磁珠外均放置于-20度保存，使用时需要对试剂盒成分进行预先的常温解冻后配置组分再进行后续的操作，特别是一些情况下需要进行反复的冻融、配比，试剂盒中独立储存试剂种类多，使用过程涉及不同试剂的融化及混匀离心，操作复杂且对操作环境要求也较高。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术提出一种冷藏保存预混试剂盒及使用方法，依据实验过程将相关试剂预混后形成预混试剂装入试剂盒，能够有效的简化实验操作步骤，同时通过对预混试剂组分进行针对性调整实现试剂在冷藏条件下的长期有效保存，避免实验使用试剂盒时需要反复冻融的繁琐操作，使实验流程显著简化。为实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案包括：一种冷藏保存预混试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有的预混试剂组分包括末端补平与连接组分、接头组分、连接酶组分和PCR组分；所述末端补平与连接组分包括末端补平与加A缓冲液、末端补平与加A酶和占所述末端补平与连接组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；所述接头组分包括连接缓冲液、接头和占所述接头组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；所述连接酶组分包括连接酶、连接缓冲液和占所述连接酶组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；所述PCR组分包括接头引物、PH8Tris缓冲液和扩增反应液的预混试剂。进一步地，所述末端补平与连接组分包括3.5uL的末端补平与加A缓冲液、1.5uL的末端补平与加A酶和占所述末端补平与连接组分整体体积10％至30％的甘油；所述接头组分包括10uL的连接缓冲液、2uL浓度为15umol/L的接头和占所述接头组分整体体积10％至30％的甘油；所述连接酶组分包括10uL的连接酶、10uL的连接缓冲液和占所述连接酶组分整体体积10％至30％的甘油；所述PCR组分包括5uL终浓度为400至1000nmol/L的接头引物(P5indexPrimer和P7indexPrimer)、20uL的PH8Tris缓冲液和25uL的扩增反应液，所述扩增反应液包括DNA聚合酶、PCR缓冲液和dNTP，例如可以采用包括2XTaqDNAPolymerase、2XPCRBuffer和2XdNTP的2XPCRMasterMix扩增反应液。优选的，可以先将5uL接头引物和20uL的PH8Tris缓冲液混合后，再与25uL的扩增反应液混合；扩增反应液中的PCR缓冲液为常规用于PCR扩增的缓冲液，例如可以包括Tris和镁离子。进一步地，所述末端补平与连接组分包括占所述末端补平与连接组分整体体积30％的甘油；所述接头组分包括占所述接头组分整体体积30％的甘油；所述连接酶组分包括占所述连接酶组分整体体积30％的甘油。进一步地，所述连接酶为10至30units/uL的T4连接酶。进一步地，所述甘油全部或部分等体积量替换为DMSO。本专利技术还涉及一种冷藏保存预混试剂盒使用方法，其特征在于，所述使用方法包括：将上述试剂盒保存在4℃冷藏条件下；使用上述试剂盒进行文库构建，不需要融化试剂过程，试剂盒中各预混试剂组分经过桌面离心机5至10秒的离心操作即可直接使用在文库构建实验操作。进一步地，所述文库构建实验操作包括：S1、使用末端补平与连接组分对预先准备的片段化DNA样品进行末端修复与加A；S2、使用接头组分和连接酶组分对加A后的DNA片段连接接头；S3、对连接有接头的DNA片段进行纯化操作获得纯化的DNA片段；S4、使用PCR组分对纯化的DNA片段进行扩增富集；S5、对扩增富集后的DNA文库进行纯化操作获得纯化后的DNA文库。进一步地，所述纯化操作包括：使用AgencourtAMPureXP磁珠进行纯化；使用80％乙醇漂洗；使用洗脱缓冲液或去离子水洗脱。本专利技术的有益效果为：采用本专利技术所述冷藏保存预混试剂盒及使用方法进行DNA文库制备实验，仅需要常规冷藏条件即可长时间保证试剂有效性，无需进行冷冻保存，简化了试剂盒保存、运输条件，在使用时，无需对试剂盒中试剂进行融化操作，避免因试剂反复冻融影响DNA文库制备实验效率；同时，经过预混操作后装入试剂盒的预混试剂组分不仅更好的支持冷藏保存试剂有效性，也简化了DNA文库制备实验操作步骤，特别是不同试剂之间的混匀过程提前完成，可以大幅提高实验效率。附图说明图1为本专利技术冷藏保存预混试剂盒使用方法流程示意图。具体实施方式为了更清楚的理解本专利技术的内容，将结合附图和实施例详细说明。现有的试剂盒，由于需要冷冻保存以维持试剂有效性(例如酶的活性)，因此实验时不能直接使用，必须先经过融化过程。本专利技术提出的冷藏保存预混试剂盒，通过不同试剂预混以及甘油的加入使试剂可以在冷藏条件下长时间保持有效性，例如存放在4℃环境中保存，使用时无需额外准备步骤，经过简短离心后可以直接用于实验，结合预混的试剂组分，大大简化了DNA文库制备实验流程。优选的，本专利技术所述冷藏保存预混试剂盒包括有四种预混试剂组分，特别是将末端补平与加A试剂预混、接头连接试剂预混以及引物预混，并针对性的加入一定量的甘油(或DMSO)以提高试剂冷藏保存性，从整体上提供了一种能够有效提高DNA文库制备实验效率的试剂盒。其中甘油(或DMSO)的加入能够显著提升试剂在冷藏条件下保持有效性的能力，特别是有助于保持试剂中酶的活性，甘油(或DMSO)的加入量以占试剂总体积比计算可取10％至30％，优选的取30％，能够实现较佳的冷藏保存效果。如图1所示为一种应用上述冷藏保存预混试剂盒在进行DNA文库构建时使用方法的优选实施例流程示意图，主要包括以下步骤：S1、使用末端补平与连接组分对预先准备的片段化DNA样品进行末端修复与加A；S2、使用接头组分和连接酶组分对加A后的DNA片段连接接头；S3、对连接有接头的DNA片段进行纯化操作获得纯化的DNA片段；S4、使用PCR组分对纯化的DNA片段进行扩增富集；S5、对扩增富集后的DNA文库进行纯化操作获得纯化后的DNA文库。相较使用现有技术试剂盒的实验操作，使用本专利技术所述冷藏保存预混试剂盒可以至少节省试剂融化解冻、不同试剂混合等操作步骤，具有更高的实验效率。以下通过本专利技术所述冷藏保存预混试剂盒在基于I本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种冷藏保存预混试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有的预混试剂组分包括末端补平与连接组分、接头组分、连接酶组分和PCR组分；/n所述末端补平与连接组分包括末端补平与加A缓冲液、末端补平与加A酶和占所述末端补平与连接组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；/n所述接头组分包括连接缓冲液、接头和占所述接头组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；/n所述连接酶组分包括连接酶、连接缓冲液和占所述连接酶组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；/n所述PCR组分包括接头引物、PH8Tris缓冲液和扩增反应液的预混试剂。/n

【技术特征摘要】
1.一种冷藏保存预混试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有的预混试剂组分包括末端补平与连接组分、接头组分、连接酶组分和PCR组分；
所述末端补平与连接组分包括末端补平与加A缓冲液、末端补平与加A酶和占所述末端补平与连接组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；
所述接头组分包括连接缓冲液、接头和占所述接头组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；
所述连接酶组分包括连接酶、连接缓冲液和占所述连接酶组分整体体积10％至30％的甘油的预混试剂；
所述PCR组分包括接头引物、PH8Tris缓冲液和扩增反应液的预混试剂。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，
所述末端补平与连接组分包括3.5uL的末端补平与加A缓冲液、1.5uL的末端补平与加A酶和占所述末端补平与连接组分整体体积10％至30％的甘油；
所述接头组分包括10uL的连接缓冲液、2uL浓度为15umol/L的接头和占所述接头组分整体体积10％至30％的甘油；
所述连接酶组分包括10uL的连接酶、10uL的连接缓冲液和占所述连接酶组分整体体积10％至30％的甘油；
所述PCR组分包括5uL的接头引物、20uL的PH8Tris缓冲液和25uL的扩增反应液，所述扩增反应液包括DNA聚合酶、PCR缓冲液和dNTP。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，
所述末端补平与连接组分包括占所述末端补平与连接组分整体体积30％的甘油；
所...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦资，祝君，李芳敏，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31