一种表观遗传修饰核酸文库的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种表观遗传修饰核酸文库的构建方法及其应用，所述方法包括以下步骤：提供模板核酸，对所述模板核酸进行PCR扩增，得到含有磷酸修饰的PCR扩增产物；采用核酸外切酶对所述PCR扩增产物进行切割，消化掉含有磷酸修饰的一条链，得到无修饰的单链DNA；对所述单链DNA进行互补配对，然后在预设位点修饰表观修饰分子，得到修饰产物；将所述修饰产物中的短链延伸补齐，得到表观修饰核酸链。本发明专利技术可以实现在目标序列的任意位点产生单个或者多个表观修饰分子修饰，从而能够为研究表观修饰核苷酸在核酸链中的位置和丰度等相关技术或方法提供标准样本。

【技术实现步骤摘要】
一种表观遗传修饰核酸文库的构建方法及其应用
本专利技术涉及表观遗传修饰核酸
，尤其涉及一种表观遗传修饰核酸文库的构建方法及其应用。
技术介绍
哺乳动物中的表观修饰主要集中在胞嘧啶核苷酸上，表观修饰形式包括5-甲基胞嘧啶(5-mC)与5-羟甲基化胞嘧啶(5-hmC)两种主要形式。而5-羟甲基化胞嘧啶能够被进一步氧化为5-醛基胞嘧啶(5-fC)和5-羧基胞嘧啶(5-caC)。而5-甲基胞嘧啶由于其含量较高，与肿瘤相关性较大，因此研究比较深入，而5-羟甲基化胞嘧啶直到最近才被认为是一种稳定的表观修饰方式，逐渐引起人们注意。随着对5-羟甲基化胞嘧啶在干细胞及小鼠脑细胞存在的首次发现，才让5-羟甲基化胞嘧啶进入了研究的热潮中来。研究表明，5-羟甲基化胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶一样，可能也是一种重要的表观遗传标记，它除了是去甲基的的中间产物，也参与了基因的表达调控。而且，醛甲基胞嘧啶和羧甲基胞嘧啶也成为了最新的研究热点，具体的生物功能有待进一步阐述。因此，提出一种适用于各种类型核苷酸的表观遗传修饰核酸文库的构建方法，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种表观遗传修饰核酸文库的构建方法及其应用，用以克服上述
技术介绍
中的技术问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术一方面提供一种表观遗传修饰核酸文库的构建方法，包括以下步骤：提供模板核酸，对所述模板核酸进行PCR扩增，得到含有磷酸修饰的PCR扩增产物；采用核酸外切酶对所述PCR扩增产物进行切割，消化掉含有磷酸修饰的一条链，得到无修饰的单链DNA；对所述单链DNA进行互补配对，然后在预设位点修饰表观修饰分子，得到修饰产物；将所述修饰产物中的短链延伸补齐，得到表观修饰核酸链。进一步地，所述PCR扩增采用两个引物，其中一个引物为5端磷酸修饰的引物，另一引物为不含任何修饰的引物，所述不含任何修饰的引物不会被所述核酸外切酶切割。进一步地，所述核酸外切酶为Lambda核酸外切酶或T7核酸外切酶。进一步地，对所述单链DNA进行互补配对，然后在预设位点修饰表观修饰分子，得到修饰产物，具体包括：提供一条与所述单链DNA互补的延伸引物，退火后组成部分双链部分单链的结合物，利用聚合酶、含有表观修饰分子和dNTP的混合物，在预设位点添加上表观修饰分子。进一步地，所述聚合酶为VentDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶中的任意一种。进一步地，所述预设位点为互补配对后的双链DNA的任意位点。进一步地，所述预设位点为限制性内切酶的切割位点。进一步地，所述表观修饰分子为羟甲基胞嘧啶、甲基胞嘧啶、醛甲基胞嘧啶、羧甲基胞嘧啶和甲基腺嘌呤中的任意一种。进一步地，所述模板核酸来源于病毒、细菌、真菌、植物和动物中的至少一种。本专利技术另一方面提供一种上述表观遗传修饰核酸文库的构建方法的应用。实施本专利技术的上述技术方案，具有如下有益效果：1、本专利技术利用PCR产生磷酸化修饰的产物，利用单链化核酸酶，产生单链的目标DNA；利用化学合成或者本方法产生与单链的目标DNA局部匹配的延伸引物；利用目标位点的鸟嘌呤或者根据目标位点选择的其他核苷酸及其后一个未知NTP为模板靶点进行羟甲基胞嘧啶修饰从而可以在目标序列的任意位点产生单个或者多个羟甲基胞嘧啶修饰，也可用于其他表观修饰分子的修饰，不受相关方法或者酶识别位点的限制；2、本专利技术方法与限制性内切酶联合使用，用来表征羟甲基胞嘧啶或者其他表观修饰分子的修饰位置和修饰效率；3、本专利技术方法建立的表观修饰核酸有多种用途，可用于研究表观修饰在基因中的作用，也可以用作检测表观修饰方法的标准样本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案和优点，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。图1是本专利技术实施例提供的表观遗传修饰核酸文库的构建方法的流程图；图2是本专利技术实施例提供的表观遗传修饰核酸文库的构建方法的原理图；图3是本专利技术实施例提供的构建方法中每一个步骤产物对应的电泳结果；图4是本专利技术实施例提供的羟甲基胞嘧啶修饰物的鉴定结果。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本专利技术作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。需要说明的是，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或服务器不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。实施例本实施例提供了一种表观遗传修饰核酸文库的构建方法，参阅图1，本实施例的表观遗传修饰核酸文库的构建方法，包括以下步骤：步骤S1、提供模板核酸，对模板核酸进行PCR扩增，得到含有磷酸修饰的PCR扩增产物。具体地，模板核酸选自基因组DNA；模板核酸来源于病毒、细菌、真菌、植物和动物中的至少一种。具体地，PCR扩增采用两个引物，其中一个引物为5端磷酸修饰的引物，另一引物为不含任何修饰的引物，不含任何修饰的引物不会被核酸外切酶切割。步骤S2、采用核酸外切酶对PCR扩增产物进行切割，消化掉含有磷酸修饰的一条链，得到无修饰的单链DNA。本实施例中，核酸外切酶为5’-3’外切脱氧核糖核酸酶，能选择性切割双链DNA中的5端磷酸化的DNA序列，对单链DNA和未磷酸化DNA的活性较低、对含有切口的DNA无活性、对缺口的DNA活性有限。在一个具体的实施方式中，核酸外切酶为Lambda核酸外切酶或T7核酸外切酶。需要说明的是，本实施例中还可以选择其他的核酸外切酶，本领域技术人员可以根据需要作任意适当的调节，本专利技术实施例对此不作限定。步骤S3、对单链DNA进行互补配对，然后在预设位点修饰表观修饰分子，得到修饰产物。在一个具体的实施方式中，该步骤具体包括：提供一条与单链DNA互补的延伸引物，退火后组成部分双链部分单链的结合物，利用聚合酶、含有表观修饰分子和dNTP的混合物，在预设位点添加上表观修饰分子。具体地，聚合酶为VentDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶中的任意一种。具体地，作为示例，表观修饰分子为羟甲基胞嘧啶、甲基胞嘧啶、醛甲基胞嘧啶、羧甲基胞嘧啶和甲基腺嘌呤中的任意一种，需要说明的是，本实施例中的表观修饰分子不限于如上所述，本领域技术人员还可以根据需要修饰其他的表观修饰分子，本专利技术实施例对此不作限定。具体地，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表观遗传修饰核酸文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/n提供模板核酸，对所述模板核酸进行PCR扩增，得到含有磷酸修饰的PCR扩增产物；/n采用核酸外切酶对所述PCR扩增产物进行切割，消化掉含有磷酸修饰的一条链，得到无修饰的单链DNA；/n对所述单链DNA进行互补配对，然后在预设位点修饰表观修饰分子，得到修饰产物；/n将所述修饰产物中的短链延伸补齐，得到表观修饰核酸链。/n

【技术特征摘要】
1.一种表观遗传修饰核酸文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供模板核酸，对所述模板核酸进行PCR扩增，得到含有磷酸修饰的PCR扩增产物；
采用核酸外切酶对所述PCR扩增产物进行切割，消化掉含有磷酸修饰的一条链，得到无修饰的单链DNA；
对所述单链DNA进行互补配对，然后在预设位点修饰表观修饰分子，得到修饰产物；
将所述修饰产物中的短链延伸补齐，得到表观修饰核酸链。


2.根据权利要求1所述的表观遗传修饰核酸文库的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增采用两个引物，其中一个引物为5端磷酸修饰的引物，另一引物为不含任何修饰的引物，所述不含任何修饰的引物不会被所述核酸外切酶切割。


3.根据权利要求1所述的表观遗传修饰核酸文库的构建方法，其特征在于，所述核酸外切酶为Lambda核酸外切酶或T7核酸外切酶。


4.根据权利要求1所述的表观遗传修饰核酸文库的构建方法，其特征在于，对所述单链DNA进行互补配对，然后在预设位点修饰表观修饰分子，得到修饰产物，具体包括：
提供一条与所述单链DNA互补的延伸引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈世兴，宋世平，李铁，王跃林，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31