植物超长DNA的提取方法技术

本发明专利技术涉及DNA提取技术领域，尤其涉及植物超长DNA的提取方法。本发明专利技术提供的植物超长DNA的提取方法，包括：细胞核分离、细胞核纯化、裂解细胞核和核内DNA纯化四个步骤，该方法提取获得的DNA符合三代测序品台对DNA质量的要求，且能够获得良好的测序效果。经电泳检测，该方法提取获得的DNA具有较长的长度，且纯度和提取率皆较高。该方法不仅适用于普通样品的提取，对于多糖、多酚含量的样品也能够实现良好的提取效果。测序结果表明，采用本发明专利技术提供的方法提取的水稻DNA，数据N50可达52.3kb，椰枣DNA，数据N50可达60.2kb。

【技术实现步骤摘要】
植物超长DNA的提取方法
本专利技术涉及DNA提取
，尤其涉及植物超长DNA的提取方法。
技术介绍
超长DNA(ultra-longDNA)，或称高分子量DNA(high-molecular-weightDNA)，是指片段长度在数百Kb甚至数Mb的DNA。超长DNA可应用于各种现代组学研究中，例如，大跨度目标区域的分离、鉴定和分析，BAC构建，YAC构建，基因组测序等。近十年来随着二代、三代测序技术的迅猛发展，植物基因组数据呈井喷式增长。但是，由于植物基因组高重复性、多倍体特性，且受限于二代测序读长短，组装获得的基因组完整性、连续性并不理想。现有研究显示，测序的读长长度是影响基因组组装完整性、连续性的关键因素，读长长度较测序深度更为重要；较长的读长，有利于转座子富集区、着丝粒区域、重复区域等结构复杂区域的组装，能够显著提高基因组组装的完整性和连续性。使用传统的DNA提取手段获得的DNA片段长度仅在50kb左右，不会超过100kb。而以NanoPore、PacBio为代表的三代测序技术具有长读长的特点，三代测序平台对DNA质量要求为：1、OD260/280比值范围在1.8～2.0，OD260/230比值范围在2.0～2.5；2、Nanodrop/Qubit比值接近于1.0；3、浓度大于等于80ng/μL；4、DNA总量大于等于10μg。传统的DNA提取手段，所提取的DNA长度、纯度不能完全达到测序平台要求。而事实上，在研究过程中发现，即便达到平台要求，一些提取方法获得的DNA样品，也不能够实现良好的测序效果。例如：某次提取的水稻样品，使用核酸定量仪对该样本进行检测，各项指标均满足测序仪要求：同时，脉冲电泳检测结果(图1)显示DNA大小集中在200Kb，并且有少量500Kb片段。但按照标准流程使用OxfordNanoporePromethION平台进行测序，上机后产出仅为24G。而该平台植物基因组测序平均产量应在50～60G。这说明核酸定量仪检测数据仅能作为参考，即便检测结果符合测序要求，也不一定就能够获得良好的测序结果。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供植物超长DNA的提取方法，该方法提取获得的DNA符合长读长测序平台对DNA质量的要求，且能够获得良好的测序效果，例如以OxfordNanopore和PacBio为代表的三代测序平台。本专利技术提供的植物超长DNA的提取方法，包括：步骤1：细胞核分离：样品与匀浆缓冲液混合，以20500rpm～35000rpm匀浆3次～5次，每次15s～25s；步骤2细胞核纯化：匀浆液以匀浆缓冲液稀释后过40μm～100μm滤膜，滤液于0～4℃，60rcf～90rcf离心2min～5min，离心后的沉淀以匀浆缓冲液重悬，-4℃～4℃裂解10min～60min；2000rcf～3000rcf离心15min～25min，沉淀以匀浆缓冲液清洗2～3次，然后用核洗涤缓冲液洗涤2～3次；步骤3：裂解细胞核：洗涤后的沉淀以含有RNaseA的核裂解缓冲液于35～40℃裂解0.5～2h，然后以ProteinaseK48℃～52℃酶解2.5～3.5h；步骤4：核内DNA纯化：酶解后的细胞核依次经苯酚抽提、苯酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提后，以无水乙醇沉淀，再以70vol％乙醇洗涤，获得植物超长DNA。步骤1中，所述样品与匀浆缓冲液的质量-体积比为1g：(8～15)mL；匀浆的条件为：35000rpm4次，每次20s。步骤1具体为：每g样品与(8～15)mL匀浆缓冲液混合，35000rpm匀浆4次，每次20s。实验证明，取样量与匀浆缓冲液的比例影响最终的提取效果，取样量过低，则样品提取后的DNA量不足，但取样量过高，则影响OD260/230的比值，使其无法符合三代测序平台对DNA的要求。研究表明，采用匀浆的方式破碎样品所得DNA质量更佳，本专利技术实施例中证明，经液氮研磨的样品上机测序后产量是8G，而均浆处理的样品产量提高至42G。步骤2中：所述匀浆液与匀浆缓冲液的体积比为1:1；所述裂解的温度为0℃，时间为30min。步骤2具体为：匀浆液以等体积的匀浆缓冲液稀释后依次过100μm、40μm的滤膜，滤液于0～4℃，80rcf离心3min，离心后的沉淀以匀浆缓冲液重悬，0℃裂解30min；2500rcf离心20min，沉淀以匀浆缓冲液清洗2～3次，然后用核洗涤缓冲液洗涤2～3次。所述过滤采用滤膜效果更优，现有技术中采用的神奇纱布(Miracloth)的过滤方法并不适用于本专利技术的方法，实验表明，经滤膜过滤获得的DNA总量为18.97μg，神奇纱布过滤获得的DNA总量为4.1μg。该方法相对于琼脂糖包埋或nanobind存在优势，具体的，用琼脂糖包埋的方法获得的DNA虽然较长，但是DNA纯度不够，通过消化和透析并不能完全去除DNA中的杂质，且耗时长。nanobind方法得到的DNA长度较短，且成本高。而本专利技术所述方法获得的DNA,长度纯度均有优势，且提取1天之内可以完成。核裂解缓冲液的添加量会影响液体粘稠度，只有合适粘稠度才能提取出高质量DNA。若添加量过少，无法彻底去除蛋白质；若过多，抽提时会导致超长DNA断裂，造成损伤。步骤3中，含有RNaseA的核裂解缓冲液与步骤1中所述样品的质量-体积比为1g：(5～20)mL。具体的，质量体积比为1g：5mL、1g：10mL、1g：15mL、1g：20mL。研究表明，对于普通样品，每克样品添加RNaseA的核裂解缓冲液的体积为5～10ml比较好而对于糖含量较多的样本，液体较粘，在这类样本的超长DNA提取中，每克样品20ml的核裂解液添加量效果最好。本专利技术采用SDS对细胞核进行裂解。SDS通常用于动物、微生物的提取，而植物中通常使用CTAB，因为CTAB对去除植物中特有的多糖多酚物质有较好的效果。但是，对于超长DNA的提取，CTAB却不占优势。CTAB法提取的DNA虽然能够符合三代测序的标准，但所得DNA的长度偏短。另外，因SDS可以破坏蛋白质中的离子键和氢键等非共价键，甚至改变蛋白质的构象，所以SDS浓度过高会影响蛋白酶K和RNaseA的作用。研究表明，SDS浓度过高，提取的DNA中会有RNA残留。SDS的浓度以0.5wt％～1.25wt％效果最好。步骤3中，所述RNaseA的浓度为3μL/mL，裂解的条件为37℃，1h；所述ProteinaseK的浓度为20μL/mL，酶解的条件为50℃，3h。步骤3具体为：洗涤后的沉淀以样品5～20倍量的含有3μL/mLRNaseA的核裂解缓冲液于37℃裂解1h，然后加入ProteinaseK至浓度为20μL/mL，50℃酶解3h；步骤4中，所述苯酚抽提后，经4500rcf离心10min，取上清；所述苯酚/氯仿/异戊醇抽提后，经45本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.植物超长DNA的提取方法，包括：/n步骤1：细胞核分离：/n样品与匀浆缓冲液混合，以20500rpm～35000rpm匀浆3次～5次，每次15s～25s；/n步骤2细胞核纯化：/n匀浆液以匀浆缓冲液稀释后过40μm～100μm滤膜，滤液于0～4℃，60rcf～90rcf离心2min～5min，离心后的沉淀以匀浆缓冲液重悬，-4℃～4℃裂解10min～60min；/n2000rcf～3000rcf离心15min～25min，沉淀以匀浆缓冲液清洗2～3次，然后用核洗涤缓冲液洗涤2～3次；/n步骤3：裂解细胞核：/n洗涤后的沉淀以含有RNaseA的核裂解缓冲液于35～40℃裂解0.5～2h，然后以Proteinase K 48℃～52℃酶解2.5～3.5h；/n步骤4：核内DNA纯化：/n酶解后的细胞核依次经苯酚抽提、苯酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提后，以无水乙醇沉淀，再以70vol％乙醇洗涤，获得植物超长DNA。/n

【技术特征摘要】
1.植物超长DNA的提取方法，包括：
步骤1：细胞核分离：
样品与匀浆缓冲液混合，以20500rpm～35000rpm匀浆3次～5次，每次15s～25s；
步骤2细胞核纯化：
匀浆液以匀浆缓冲液稀释后过40μm～100μm滤膜，滤液于0～4℃，60rcf～90rcf离心2min～5min，离心后的沉淀以匀浆缓冲液重悬，-4℃～4℃裂解10min～60min；
2000rcf～3000rcf离心15min～25min，沉淀以匀浆缓冲液清洗2～3次，然后用核洗涤缓冲液洗涤2～3次；
步骤3：裂解细胞核：
洗涤后的沉淀以含有RNaseA的核裂解缓冲液于35～40℃裂解0.5～2h，然后以ProteinaseK48℃～52℃酶解2.5～3.5h；
步骤4：核内DNA纯化：
酶解后的细胞核依次经苯酚抽提、苯酚/氯仿/异戊醇抽提、氯仿/异戊醇抽提后，以无水乙醇沉淀，再以70vol％乙醇洗涤，获得植物超长DNA。


2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤1中，
所述样品与匀浆缓冲液的质量-体积比为1g：(8～15)mL；
匀浆的条件为：35000rpm，4次，每次20s。


3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤2中：
所述匀浆液与匀浆缓冲液的体积比为1:1；
所述过40μm～100μm滤膜具体为依次过100μm、40μm滤膜；
所述裂解的温度为0℃，时间为30min。


4.根据权利要求1或3所述的提取方法，其特征在于，步骤2具体为：
匀浆液以等体积的匀浆缓冲液稀释后依次过100μm、40μm的滤膜，滤液于0～4℃，80rcf离...

【专利技术属性】
技术研发人员：程相锦，余晓露，夏琦，朴民圣，汪德鹏，
申请(专利权)人：武汉未来组生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42