获得源自胸腺组织的调节性T细胞的方法及所述细胞作为细胞免疫疗法在免疫系统失调中的用途技术方案

本发明专利技术提供了一种从胸腺组织获得和纯化调节性T细胞(或thyTreg细胞)的体外方法，这使得从单个胸腺获得超过100亿个细胞成为可能。除了从临床角度来看是安全的以外，本发明专利技术中获得的这些thyTreg具有超过95％的纯度和非常高的抑制能力、存活率和活力。前述内容将不需要使用大量离体细胞扩增方案。将这些thyTreg细胞转移至患者能够诱导免疫耐受。因此，所述细胞可以用作细胞疗法以在治疗和/或预防移植排斥和自身免疫疾病中诱导免疫耐受。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】获得源自胸腺组织的调节性T细胞的方法及所述细胞作为细胞免疫疗法在免疫系统失调中的用途
本专利技术属于临床免疫学和细胞免疫疗法的领域，特别是属于用于获得和纯化调节性T细胞(Treg)的方案，该调节性T细胞可随后在细胞疗法中被转移到患者中用于例如在移植个体或经受自身免疫过程者中诱导免疫耐受的目的。
技术介绍
长期归因于免疫系统的主要功能是保护生物体免受病原体侵害的功能。然而，现在我们知道免疫系统还负责消除肿瘤细胞和预防癌症的发展，并且其还可以引起由于出现自身免疫过程、过敏或移植排斥而导致的反应不足。免疫系统的正常功能只有在存在对正常功能来说充足的平衡或体内平衡时才有可能，如此，过度反应将引起诸如过敏或排斥反应的病理状态，而反应缺乏则将导致感染和癌症的进展。近年来，我们已经目睹了革命性的使用免疫细胞的细胞疗法出现在癌症治疗中，该疗法试图诱导或恢复对肿瘤的特异性免疫反应，并修补造成这些病理的患者免疫缺陷。对患者的免疫细胞进行遗传修饰以便以特定方式攻击肿瘤的“CART细胞”技术就是这种情况。像Novartis或Gilead这样的公司已经开发出这种细胞疗法来治疗B型白血病，实现了约80％的缓解，并且该疗法最近已获得FDA和EMA的批准，这代表着癌症治疗的真正的革命(MaudeS.L.,etal.,2014,NEnglJMed.,371(16):1507-17；LeeD.W.,etal.,2015,Lancet,385(9967):517-528)。然而，在相反意义上，尚未开发出具有相似效果，即诱导免疫耐受以预防或治愈自身免疫疾病或同种异体移植物排斥的细胞疗法。尚未开发出明显成功地减少过度免疫反应并恢复免疫耐受的免疫疗法。当前，使用免疫抑制药来治疗自身免疫疾病和免疫排斥。自从20世纪60年代出现这些药以来，移植实践变得可行，但是，尽管这些药有所改进，它们仍不能为排斥反应提供明确的解决方案，并且持续引起副作用，该副作用是患者的临床演变中的决定因素。具体来说，长期的免疫抑制引起慢性毒性，所述慢性毒性除了显著影响患者的生活质量外，还影响治疗的完成、患者和移植物的总体成功率以及存活。由于大多数免疫抑制剂以非选择性方式起作用，因此整个系统被阻抑和/或失去控制，从而丧失了其保卫宿主抵抗感染或肿瘤细胞繁殖的能力或产生了引起移植器官衰竭的血管损伤。此外，在儿童时期，持续施用免疫抑制剂可能会干扰正常发育，并干扰该时期中发生的免疫系统的适当成熟，这可能在改变患者的免疫能力方面导致终生后果。这些免疫抑制药将来可能会继续改善，从而进一步降低排斥率；然而，这种策略的弊端常常是引起免疫系统的退化和慢性损伤。即使能够更好地预防移植物排斥，与免疫系统的退化有关的病症(如感染、癌症和自身免疫疾病)也将继续限制接受免疫抑制药的移植患者的长期存活。为此，实现将无限期地避免影响上百万人的排斥或自身免疫疾病的免疫耐受已成为现代医学的主要挑战。科学界当前的观点是，只有一种涉及再训练(re-educating)移植受者的免疫反应的免疫耐受诱导会允许移植物无限期存活或预防和治愈自身免疫过程。这种耐受诱导会使耐受移植器官成为可能而无需药理学免疫抑制，从而消除了这些疗法的毒性作用及其对免疫系统的损伤作用。增加移植患者预期寿命的最有希望的替代方案之一是借助细胞免疫疗法诱导免疫耐受，这将使移植物无限期存活，而没有与免疫抑制治疗相关的病状(SicardA.,etal.,2015,FrontImmunol；6:149)。该方法集中于有意地减少对移植物的特异性免疫反应，同时消除或显著降低长期的药理学抑制，从而维持有效的免疫系统。免疫耐受是免疫系统的基本特征，能够诱导这种耐受的具有抑制能力的淋巴细胞亚群的发现在临床领域正引起广泛的热情。被称为调节性T细胞(Treg)的这些细胞构成免疫系统的基本部分，并且在预防移植物排斥或自身免疫疾病以及维持对患者有益的免疫稳态方面能够起到至关重要的作用。Treg能够抑制多种细胞的效应功能，所述多种细胞包括TCD4+和CD8+、NK细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞(SakaguchiS.,etal.,2008,Cell；133:775-87)。因此，Treg细胞已成为研究自身免疫、过敏和移植的令人关注的领域。因此，使用Tregs的细胞疗法被假定成为治疗由免疫系统反应过度或不足介导的疾病(如自身免疫过程(BluestoneJ.A.,etal.,2015,ExpertOpin.Ther.Targets；19:1091-103)、骨髓移植患者的移植物抗宿主病(BrunsteinC.G.,etal.,2016,Blood；127:1044-51)或移植排斥(SafiniaN.,etal.,2015,FrontImmunol；6:438))的巨大希望。Tregs在移植物中的基本作用已在皮肤和心脏移植动物模型的各种研究中得到证实，证明在移植时存在于容器(receptacle)中的Treg对于诱导和维持对移植物的耐受性至关重要(WoodK.J.,SakaguchiS.,2003,Nat.Rev.Immunol.；3:199-210)。这些Treg细胞将阻碍效应T细胞的活化和扩增，而效应T细胞是造成细胞性排斥的原因。另外，Tregs还可以诱导B细胞死亡，从而预防体液性排斥，如在心脏异种移植模型中已经证明的那样(MaY.,etal.,2008,Xenotransplantation；15:56-63)。该领域的现有知识指出了一种假说，即移植患者或具有自身免疫过程者的免疫耐受由Treg细胞与效应T细胞的平衡决定。因此，预期更大量的循环性Treg将能够预防触发这些疾病的效应细胞活化和增殖。因此，在预防排斥或治疗自身免疫过程中可提供优异结果的治疗策略是通过Treg细胞转移来进行细胞疗法，以大幅增加Treg细胞在循环中的数量，并且从而加强受者对移植器官或对自身组织的在接受体中的内在耐受机制。患者中的自体Treg的转移通过以下实现：从患者中抽取血液，纯化存在于所述血液中的Treg，离体扩增这些Treg以获得合适的数量以及将扩增的自体Treg转移回患者。如下所述，其他小组已经证明了它们在动物模型中对预防排斥的有效性，甚至已经在其他疾病中进行了临床试验，证实了它们在人体中的治疗用途。已经进行的第一批I/II期试验中反映了Treg疗法在人体中的安全性和潜在有效性。大多数使用Treg的临床试验都是在对血液肿瘤患者进行骨髓移植的背景下进行的，显示在这些患者中输注Treg减少或预防了移植物抗宿主病(GvHD)(BrunsteinCG.etal.,2016,Blood.127(8):1044-51；DiIanniM.etal.,2011,Blood.117(14):3921-8)。GvHD的最大风险发生在前三个月，并且已经证明了在该短时期中通过Treg疗法的免疫抑制足以提供长期的耐受性。然而，在实体器官移植或自身免疫疾病的情况下，该风险在患者或移植物的整个生命周期中持续存在，这需要Treg的保护作用适时地持续存在以确保预防免疫反应不足。名为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从分离的胸腺组织中获得调节性T(Treg)细胞群的体外方法，包括以下步骤：/na.机械分解所述胸腺组织；/nb.过滤阶段(a)之后获得的产物，并将包含胸腺细胞的沉淀物重悬于培养基中；/nc.从阶段(b)之后获得的产物中分离CD25+细胞；/nd.在存在T细胞活化剂和IL-2的情况下在培养基中培养阶段(c)之后获得的细胞群，优选其中所述T细胞活化剂至少包含CD3和CD28激动剂；和/ne.从阶段(d)的培养基中除去所述T细胞活化剂；/nf.任选地，在存在IL-2的情况下在培养基中进一步培养所述调节性T细胞；/n条件是在步骤(d)之前，细胞群中的CD8+细胞未被耗竭。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180301 ES P2018301971.一种从分离的胸腺组织中获得调节性T(Treg)细胞群的体外方法，包括以下步骤：
a.机械分解所述胸腺组织；
b.过滤阶段(a)之后获得的产物，并将包含胸腺细胞的沉淀物重悬于培养基中；
c.从阶段(b)之后获得的产物中分离CD25+细胞；
d.在存在T细胞活化剂和IL-2的情况下在培养基中培养阶段(c)之后获得的细胞群，优选其中所述T细胞活化剂至少包含CD3和CD28激动剂；和
e.从阶段(d)的培养基中除去所述T细胞活化剂；
f.任选地，在存在IL-2的情况下在培养基中进一步培养所述调节性T细胞；
条件是在步骤(d)之前，细胞群中的CD8+细胞未被耗竭。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)包括在存在培养基并且不使用酶的情况下机械分解所述胸腺组织。


3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其特征在于，步骤c)中的分离CD25+细胞包括使用与抗CD25抗体缀合的磁珠。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，阶段(d)所述的T细胞活化剂包括CD3和CD28激动剂。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，阶段(d)所述的T细胞活化剂是与人源化CD3和CD28激动剂缀合的胶体聚合物纳米基质。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中培养所述细胞至少2或3天，优选至少3天。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中在不存在雷帕霉素的情况下培养所述细胞。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，阶段(e)的除去借助离心进行。


9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤f)中在存在IL-2的情况下再培养所述调节性T细胞1至7天，优选再培养4天。


10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤f)中在不存在雷帕霉素的情况下培养所述细胞。


11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基是GMP培养基。


12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基还包含抗生素，优选地为5％的抗生素。


13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其特征在于，所获得的Treg细胞群包含至少80％，优选至少85％，更优选至少90％的CD4+、CD25+且Foxp3+的细胞。


14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，所述胸腺组织来自人。

【专利技术属性】
技术研发人员：R·科雷亚·罗沙，M·皮昂，E·贝纳尔多·德·奎罗斯·普拉扎，
申请(专利权)人：格雷戈里奥马拉尼翁医院生物医学研究基金会，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES