产生T细胞谱系细胞的方法技术

提供了产生T细胞谱系细胞的方法，其包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体；以及(b)分离T细胞谱系细胞。在一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是T细胞祖细胞或成熟T细胞。还提供了组合物、试剂盒及其用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生T细胞谱系细胞的方法相关申请的交叉引用本申请要求享有2018年2月14日提交的美国临时申请No.62/630,497的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。
本申请涉及用于产生T细胞谱系细胞的方法、组合物和试剂盒及其用途。具体地，本申请涉及用于产生祖细胞和成熟T细胞的方法、组合物和试剂盒及其用途。
技术介绍
T细胞是适应性免疫的关键介质，并且可以被用作针对病原体和癌症免疫疗法的治疗剂。造血干细胞移植(HSCT)为广泛的恶性和非恶性病症提供了有效的治疗方法，但治疗前所需的预处理方案会导致T细胞恢复的延时(Krenger等，2011)。与在骨髓(BM)中发育的大多数其他造血谱系相反，T细胞发育需要源自BM的祖细胞迁移到胸腺，其中进入的淋巴细胞祖细胞接收关键信号以诱导其分化为T谱系细胞(Shah和Zuniga-Pflucker，2014)。通过胸腺基质细胞递送至进入的淋巴细胞祖细胞的关键信号由Notch配体Delta-样-4介导，Notch配体Delta-样-4由皮质胸腺上皮细胞表达(Thompson和Zuniga-Pflucker,2011)。淋巴细胞祖细胞表达的Notch受体需要由载有Delta-样-4的细胞诱导的机械拉力以有效诱导Notch受体的激活(D'Souza等，2010；Gordon等，2015；Meloty-Kapella等，2012)。另外，T细胞发育已证实需要恒定且高水平的Notch受体激活(Schmitt等，2004)。在没有Notch1受体信号或Delta-样-4所诱导信号的情况下，在胸腺中T细胞的发育不会发生，取而代之的是其他淋巴细胞谱系如B细胞的发育。因此，胸腺内T细胞的发育基于Notch信号通路(Zuniga-Pflucker，2004)。在HSCT的情形下，处理和老化分别导致的胸腺功能障碍或萎缩，加之移植的HSC能力有限，使得淋巴细胞抑制胸腺中T细胞的发育程度(Porter和June，2005)。这导致免疫监测不足，使患者易于感染和/或复发癌症，并且仍然是严重的临床挑战。T细胞祖细胞(proT)的过继转移已成为一种有前途的策略，用以增强T细胞的重建，因为人或小鼠的proT细胞已经证实可定植入(engraft)免疫缺陷小鼠的胸腺，尽管它们源自异种或同种异体(Awong等，2009；Awong等，2013；Zakrzewski等，2006；Zakrzewski等，2008)。ProT细胞发育不成熟，并在宿主胸腺中经历阳性和阴性选择。因此，它们受限于受体的主要组织相容性复合体(MHC)产生的宿主耐受的T细胞，所述宿主耐受的T细胞可绕开与移植物抗宿主病(GVHD)相关的临床挑战。重要的是，proT细胞的定植(engraftment)可恢复胸腺的架构，并改善后续源自HSC的祖细胞在胸腺中的植入。除了其固有的再生医学特性外，proT细胞还可以用T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体(CAR)进行工程化改造，从而赋予对肿瘤相关抗原(TAA)的特异性以治疗癌症，还可以用合成基因线路进行工程化改造以构建定制化的响应程序。该领域中尚未解决的挑战是开发易于从不同来源的人造血干/祖细胞(HSPC)规模化产生大量proT细胞的临床相关系统。先前的方法依赖于鼠源的OP9细胞，该OP9细胞表达Notch配体Delta-样-1(DL1)或Delta-样-4(DL4)，然而，这种方法对临床转化提出了一些挑战(Awong等，2009；Awong等，2013)。大多数用于无基质细胞方法的策略都依赖于二维(2D)组织培养平台，从而将Notch配体、DL1或DL4固定在组织培养板上(Gehre等，2015；Reimann等，2012；Simons等，2017)。其他粘附受体配体，如血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)，也属于这种形式(Shukla等，2017)。使用这些策略产生的人proT细胞已经显示可成功地重建免疫缺陷小鼠的胸腺。尽管该进展是令人鼓舞的，但使用这些方法产生proT细胞用于治疗，受限于临床生产对规模化的需求，并且其并非常规产生临床可用的大规模细胞数量的方法。理想状况下，真正可规模化的平台应允许proT细胞在封闭的自动化生物反应器系统中生长(Lipsitz等，2016)。专利技术概述本专利技术人开发了一种无细胞的基于珠子的系统，用于从小鼠或人的造血干/祖细胞(HSPC)和诱导性多能干细胞(iPSC)产生T细胞谱系细胞。不与板结合的Notch配体的悬液(例如DL4-μbead)可有效产生T谱系细胞，所述T谱系细胞包括T细胞祖细胞和成熟T细胞。因此，本公开提供了产生T细胞谱系细胞的方法，其包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体，以及(b)分离T细胞谱系细胞。在一个实施方案中，所述悬浮支持物是颗粒。在另一个实施方案中，所述悬浮支持物是微珠。在一个实施方案中，所述具有Notch配体的干细胞或祖细胞为悬浮培养。在另一个实施方案中，所述干细胞选自：造血干细胞/祖细胞(HSPC)、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。在另一个实施方案中，所述干细胞是人干细胞，任选地为CD34+或CD34+CD38-/loHSPC。在另一个实施方案中，所述干细胞是CD34+造血前体细胞，任选地为从iPSC分化而来的CD34+造血前体细胞。在另一个实施方案中，所述Notch配体是DL1或DL4。在另一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是T细胞祖细胞(proT)。在另一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞是人类细胞，且所述proT细胞具有CD34+CD7+或CD7+CD5+CD1a-表型。在另一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞是小鼠细胞，任选地为谱系-CD117+Sca-1+小鼠细胞，且所述proT细胞具有CD25+或CD25+CD90+表型。在另一个实施方案中，所述T细胞谱系细胞是CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8+CD3+双阳性细胞、CD8+CD3+单阳性细胞或CD4+CD3+单阳性细胞。在另一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞培养于无基质细胞的培养基。在另一个实施方案中，所述干细胞或祖细胞与至少一种T细胞共刺激分子一起培养，所述T细胞共刺激分子结合至悬浮支持物，任选地其中所述至少一种T细胞共刺激分子是VCAM1。本公开还提供了T细胞谱系细胞，其中所述细胞由以下方法产生，所述方法包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体，以及(b)分离T细胞谱系细胞。在一个实施方案中，所述细胞是T细胞祖细胞、CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8+CD3+双阳性细胞、CD8+CD3+单阳性细胞或CD4+CD3+单阳性细胞。本公开还提供了一种悬浮Notch配体，其包含(a)Notch配体和(b)悬浮支持物(任选地为微珠)，其中所述Notch配体缀合至所述悬浮支持物。...

【技术保护点】
1.产生T细胞谱系细胞的方法，其包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体；以及(b)分离T细胞谱系细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180214 US 62/630,4971.产生T细胞谱系细胞的方法，其包括：(a)培养包含干细胞或祖细胞的样本，其中所述干细胞或祖细胞具有缀合至悬浮支持物的Notch配体；以及(b)分离T细胞谱系细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述悬浮支持物是颗粒。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述悬浮支持物是微珠。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述具有Notch配体的干细胞或祖细胞为悬浮培养。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述干细胞选自：造血干/祖细胞(HSPC)、胚胎干细胞或诱导性多能干细胞(iPSC)。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述干细胞是CD34+或CD34+CD38-/loHSPC。


7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述干细胞是CD34+造血前体细胞，任选地为从iPSC分化而来的CD34+造血前体细胞。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述Notch配体是DL4。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述T细胞谱系细胞是T细胞祖细胞(proT)。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞是人类细胞，并且所述proT细胞具有CD34+CD7+或CD7+CD5+CD1a-表型。


11.根据权利要求10所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞是小鼠细胞，任选地为谱系-CD117+Sca-1+小鼠细胞，并且所述proT细胞具有CD25+或CD25+CD90+表型。


12.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述T细胞谱系细胞是CD4+CD8+双阳性细胞、CD4+CD8+CD3+双阳性细胞、CD8+CD3+单阳性细胞或CD4+CD3+单阳性细胞。


13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞培养于无基质细胞的培养基。


14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述干细胞或祖细胞与至少一种T细胞共刺激分子一起培养，所述T细胞共刺激分子结合至悬浮支持物，任选地其中所述至少一种T细胞共刺激分子是VCAM1。
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【专利技术属性】
技术研发人员：J·C·阻尼加普鲁科尔，M·莫塔希亚米，A·特罗特曼格兰特，
申请(专利权)人：桑尼布鲁克研究所，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA