产生自然杀伤细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于产生自然杀伤(NK)细胞的方法。更具体地，本发明专利技术涉及一种产生NK细胞的方法，其特征在于从其去除CD3阳性细胞的外周血单核细胞与支持细胞一起增殖，并且在达到累积分裂次数特定数量的时间用支持细胞再刺激所述外周血单核细胞。本发明专利技术还涉及一种产生NK细胞的方法，其特征在于通过使用生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞。根据本发明专利技术的产生方法的优点在于，与现有方法相比，可以通过临床友好的方法在短时间段内以高纯度和高效率产生具有高细胞杀伤能力和细胞存活率的NK细胞，从而增加了NK细胞治疗剂的生产率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】产生自然杀伤细胞的方法
本申请涉及一种用于产生自然杀伤(NK)细胞的方法，更具体地涉及一种产生NK细胞的方法，其特征在于从其去除CD3阳性细胞的外周血单核细胞与饲养细胞一起增殖，并且在达到特定积累群体倍增水平的时间用饲养细胞再刺激所述外周血单核细胞。本申请还涉及一种产生NK细胞的方法，其特征在于通过使用生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞。
技术介绍
自然杀伤(NK)细胞是淋巴样细胞，其占血细胞的约10％并且在免疫应答中发挥重要作用。NK细胞具有许多功能。具体地，它们用于去除已经经历或正在经历肿瘤化的异常细胞，因为NK细胞具有杀伤癌细胞、被外来入侵的病原体感染的细胞等的能力。大多数NK细胞通常以失活状态存在于体内。但是，为了出于治疗性目的而使用NK细胞，需要激活NK细胞。因此，积极地进行了关于激活来自正常血液或来自具有失活NK细胞的患者的血液的NK细胞的研究。通过离体激活NK细胞实现的NK细胞的高细胞毒性证明了NK细胞用于免疫细胞疗法的可能性。据报告，离体激活的NK细胞在同种异体骨髓移植之后向患者给予时，对于各种癌症，特别是血液癌症诸如白血病具有治疗性作用(BloodCellsMolecules&Disease,33:第261-266页,2004)。同时，虽然NK细胞可能作为治疗剂，但是体内存在的NK细胞的数量并不大，并且因此需要产生大量NK细胞同时维持足以用于治疗性目的的效率的技术。然而，NK细胞在体外的大量培养和增殖是不够的。因此，用于在可用水平下培养和扩增NK细胞的技术受到了关注，并且对其进行了许多研究。但是，研究结果仍不适用于临床。已经进行了关于NK细胞培养的研究，不仅使用用于T细胞增殖/激活的IL-2，并且还使用IL-15(J.Immunol.,167(6):第3129-3138页,2001；Blood,106(1):第158-166页,2005,韩国专利公开号2009-0121694)、LPS(J.Immunol.,165(1):第139-147页,2000)和刺激CD3的OKT-3抗体(ExperimentalHematol.,29(1):第104-113页,2001)来。然而，此类研究仅发现了使用IL-2和新增殖物的修改，但是并未提出划时代的增殖方法。通常已知的是，当使用IL-2或其他细胞因子或化学物培养NK细胞时，NK细胞的数量相对于NK细胞的初始数量仅增加约3-10倍。一些研究人员报告，使用肿瘤细胞系作为饲养细胞来扩增NK细胞。据报告，使用白血病细胞系CTV-1作为饲养细胞显示很少的增殖改善(J.Immunol.,178(1):第85-94页,2007)，并且使用EBV-LCL培养21天使细胞数量增加平均约490倍(Cytotherapy,11(3):第341-355页,2009)。另外，使用通过在K562细胞中表达4-1BBL和膜结合的IL-15获得的人工抗原呈递细胞(APC)共培养NK细胞3周使NK细胞数量增加约227倍。最近，据报告，在用MICA、4-1BBL和IL-15转染的K562细胞中共培养NK细胞3周使NK细胞数量增加平均350倍(TissueAntigens,76(6):第467-475页,2010)，并且报告了，在用膜结合的IL-21转染的K562细胞培养NK细胞2周同时以7天间隔再刺激所述NK细胞时，细胞数量增加平均21,000倍。然而，因为使用癌细胞来增殖NK细胞，这些结果是使用不适合于保证安全性的方法获得的，安全性对于临床应用很重要。此外，因为使用特定癌细胞而非正常细胞作为饲养细胞，所以存在所得的NK细胞对于特定癌细胞具有引发特异性的限制。通过从外周血白细胞(PBL)选择性富集NK细胞而不分离NK细胞获得的细胞与纯NK细胞相比具有较低的细胞杀伤能力，并且不仅含有NK细胞，并且还含有通过自体MHC分子识别自我细胞和非自我细胞的T细胞。因此，只要不去除T细胞，所述细胞的使用就受限于自体移植。最近，已经开发了一种分离NK细胞并且通过使用饲养细胞施加合适的刺激扩增分离的NK细胞的方法，以及一种使用全PBL或外周血单核细胞(PBMC)选择性扩增NK细胞的方法。此外，报告了一种用于培养NK细胞的方法，其包括在外周血白细胞的存在下使用含有抗CD3抗体和白介素蛋白的培养基培养NK细胞的工艺(韩国专利公开号10-2010-0011586)。用于NK细胞的同种异体应用的一般表达工艺以磁性耗尽CD3+细胞和富集CD56+NK细胞的两个顺序步骤开始。为了刺激NK细胞增殖，经常使用经辐照的饲养细胞诸如PBMC(Cytotherapy12:750-763,2010)或Epstein-Barr病毒转化的类淋巴母细胞细胞系(EBV-LCL)。经辐照的饲养细胞通过体液因子和直接细胞与细胞接触两者来刺激NK细胞(Blood80:2221-2229,1992)。针对NK细胞的大规模增殖和激活，本申请的专利技术人已经通过以下方式来制备CD3-CD16+CD56+NK细胞的高纯度群体：在CD3+细胞的磁性耗尽的单一步骤之后，在OKT3和IL-2的存在下，刺激去除T细胞的PBMC并且使它们与失活的饲养细胞一起重复增殖(韩国专利注册号1,644,984)。然而，所述方法限于获得大量高纯度的NK细胞。因此，本申请的专利技术人一直在努力开发一种用于制备大量具有高杀伤能力的高纯度NK细胞的方法。因此，他们认识到，当通过与饲养细胞一起静置培养来刺激从其去除CD3阳性细胞的外周血单核细胞，在外周血单核细胞的积累群体倍增水平(aPDL)达到2-6时的时间用饲养细胞再刺激，并且然后进行悬浮培养时，NK细胞的生长增强并且细胞回收率得以改善，并且完成本申请。此外，本申请的专利技术人首先认识到，使用生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞明显提高所获得的NK细胞的量和所制备的NK细胞的杀伤能力，并且完成本申请，所述生物反应器允许控制培养基中的溶解氧浓度、溶解二氧化碳浓度、pH和温度、充分搅动、培养基的连续供应等。
技术实现思路
技术问题本申请涉及提供一种产生NK细胞的方法，其通过在达到特定积累群体倍增水平时用饲养细胞再刺激细胞培养物中的单核细胞来允许明显增强的NK细胞生长和显著提高的NK细胞回收率。本申请还涉及提供一种产生NK细胞的方法，其特征在于通过使用生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞。技术方案一方面，本申请提供了一种产生NK细胞的方法，其包括：(a)用饲养细胞刺激含有NK细胞的细胞培养物并且然后对其进行静置培养的步骤；(b)对静置培养的细胞培养物进行悬浮培养的步骤；以及(c)通过在细胞培养物中的单核细胞的积累群体倍增水平达到3-5时的时间添加饲养细胞来再刺激悬浮培养的细胞培养物并且然后对其进行悬浮培养的步骤。另一方面，本申请提供了一种产生NK细胞的方法，其特征在于通过使用搅动式生物反应器在适当的培养条件下培养NK细胞。附图说明图1示出了根据静置培养和悬浮培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：/n(a)用饲养细胞刺激包含NK细胞的细胞培养物，并且然后对其进行静置培养；/n(b)对所述静置培养的细胞培养物进行悬浮培养；以及/n(c)通过在所述细胞培养物中的单核细胞的积累群体倍增水平达到3-5时的时间添加饲养细胞来再刺激所述悬浮培养的细胞培养物，并且然后对其进行悬浮培养。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180323 KR 10-2018-0033828;20190320 KR 10-2019-001.一种产生NK细胞的方法，所述方法包括：
(a)用饲养细胞刺激包含NK细胞的细胞培养物，并且然后对其进行静置培养；
(b)对所述静置培养的细胞培养物进行悬浮培养；以及
(c)通过在所述细胞培养物中的单核细胞的积累群体倍增水平达到3-5时的时间添加饲养细胞来再刺激所述悬浮培养的细胞培养物，并且然后对其进行悬浮培养。


2.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中在所述步骤(a)中用饲养细胞进行的所述刺激之后3-7天开始所述步骤(b)的所述悬浮培养。


3.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中所述步骤(c)的所述悬浮培养在30-300rpm的搅动速度下进行。


4.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中所述步骤(a)的所述培养在向其添加抗CD3抗体的培养基中进行。


5.根据权利要求4所述的产生NK细胞的方法，其中所述抗CD3抗体是选自OKT3、UCHT1和HIT3a的一种或多种。


6.根据权利要求1所述的产生NK细胞的方法，其中所述步骤(a)的所述培养在向其添加一种或多种选自白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)、白介素-15(IL-15)、白介素-18(IL-18)和白介素-21(IL-21)的细...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄琉炅，白相勋，韩升烈，李尚贤，南亨辰，金周映，M·R·韩，鲁东一，
申请(专利权)人：GC细胞治疗，
类型：发明
国别省市：韩国;KR