用于T细胞活化和扩增以用于免疫疗法的三维生物反应器制造技术

本发明专利技术涉及三维(3D)生物反应器在用于免疫疗法的T细胞扩增中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于T细胞活化和扩增以用于免疫疗法的三维生物反应器专利
本公开内容涉及三维(3D)生物反应器在用于免疫疗法的T细胞扩增中的应用。在本专利技术中描述的生物反应器也能够用于其他淋巴细胞例如B细胞和天然杀伤细胞或通常非贴壁细胞的扩增。背景癌症免疫疗法(其代表着医学中生物技术革命的最新阶段)是利用患者自身的免疫系统来治疗癌症。最近的成功案例是基于嵌合抗原受体(CAR)T细胞的癌症治疗。典型的CART细胞疗法过程是这样的过程：其中将从患者自身血液收集的T淋巴细胞遗传改造以在其表面上产生特殊的受体CAR，从而使得T细胞能够识别和攻击癌细胞。经过改造的CART细胞在实验室中生长，并扩增到数以亿计的数量，然后被注射回患者体内以杀死癌细胞。随着CART细胞疗法的成功，下一个问题是如何使其更安全和更具成本效益。当前的T细胞改造过程通常仍基于使用磁珠来与T细胞一起孵育。磁珠在其表面上用CD3和CD28涂布以充当活化T细胞的抗原，以使得它们能够增殖。悬浮在具有T细胞的细胞培养基中的微珠为T细胞提供了相对较大的表面区域以与CD3和CD28接触并暂时结合，然后活化。在T细胞生长到一定密度后，将T细胞和磁珠移入相对较大的生物反应器(例如GE的WAVE生物反应器)中，以继续刺激和扩增的过程。重复该过程多次以生长相对大量的T细胞。收获时，必须使用磁力分离器将T细胞与珠子分离。因此，当前的T细胞扩增过程通常依赖于磁珠、多阶段处理和手动相互作用，这不具有成本效益。此外，它是一个开放式系统，其可以容易地引入污染物并使其相对更昂贵(expansive)以满足良好操作规范(GMP)的要求。因此，仍然需要通过提供改善的生物反应器设计、具有成本效益的制造技术以及改善的生物反应器操作能力以达到临床应用剂量要求来改善细胞扩增、特别是T细胞扩增的方法和装置。概述用于T细胞扩增的方法包括：(a)提供3D生物反应器，该3D生物反应器包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D＞d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有不超过+/-10.0％变化的所选空隙体积(V)；和(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；(b)提供在所述生物反应器的用于细胞扩增的表面区域上的聚多巴胺涂层；(c)提供附着于所述聚多巴胺涂层的四聚体蛋白，例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白；(d)提供固定在所述四聚体蛋白上的一种或多种生物素化抗体；(e)使T细胞流过具有T细胞受体的所述3D生物反应器并被活化，其中所述T细胞受体与所述生物素化抗体结合；(e)将活化的T细胞暴露于含有信号传导分子(例如细胞因子)的灌注培养基中，以促进T细胞扩增。附图的简要说明图1示出了3D生物反应器固定床的剖视图。图1a示出了生物反应器的单元负模型，其显示了相邻球体的重叠。图1b示出了单元负模型，其中每个球被12个相同的相邻球体包围。图1c示出了3D生物反应器固定床的几何形状，其显示了相互连接的空隙系统。图1d以断面图示出了3D生物反应器固定床的几何形状。图1e以2D视图示出了3D生物反应器的被识别的球形空隙及其重叠区域，用以在球形空隙之间形成相互连接的孔。图2示出了定位在具有用于流体灌注的入口和出口的壳体中的3D生物反应器固定床。图3示出了典型的3D生物反应器灌注系统。图4a、4b、4c和4d显示了流过3D生物反应器的流速分布。图4e指示流过3D生物反应器的流速的标尺。图5a和5b示出了3D生物反应器中的表面剪切应力的分布。图5c指示以Pa为单位的剪切应力的标尺。图6a示出了圆柱形3D生物反应器中沿流动方向的压降(梯度)。图6b指示压力的标尺。图7a示出了通过FDM3D打印产生的3D生物反应器固定床。图7b示出了与生物反应器腔室一起的3D生物反应器固定床。图7c示出了3D生物反应器的入口和出口。图7d示出了组装的3D生物反应器。图7e示出了通过SLA3D打印产生的3D生物反应器固定床。图7f示出了通过DLP3D打印产生的3D生物反应器固定床。图8示出了放置在3D生物反应器的入口和出口处以接近层流的两个流体分配器。图9示出了当使用流体分配器时流过3D生物反应器的流速分布。图10a和10b示出了通过替代的成孔剂浸出方法形成3D生物反应器。图11示出了将抗体固定在3D生物反应器的球形空隙体积上以用于结合和活化T细胞。图12示出了用于T细胞活化和扩增的无珠子的基于闭环灌注的3D生物反应器。图13示出了不同浓度的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白涂层的荧光强度。荧光标记的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白用于显示涂布在生物反应器表面上的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的浓度。图14示出了在抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白上的生物素涂层的荧光强度。荧光标记的生物素用于显示结合到抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白上的生物素的浓度。图15示出了使用抗体涂布的磁珠和生物反应器基质相对于没有抗体涂层的生物反应器基质孵育(静态)的T细胞生长(在珠子活化之后)。图16分别示出了用具有抗体涂层的珠子、生物反应器基质和不具有抗体涂层的生物反应器基质孵育(静态)的T细胞活化和扩增。图17示出了在使用连续灌注的3D生物反应器中的T细胞活化和扩增。优选实施方案的详述本公开内容涉及基于灌注的可扩展生物反应器设计，其具有用于实现用于免疫疗法目的的T细胞扩增的相应操作能力。来自患者的T细胞的活化和扩增(例如在基因修饰后)提供了一种治疗性T细胞产品，其能够被灌注回给患者，并以选择性地靶向并杀死患者的肿瘤细胞的方式使用患者自身的免疫系统。本文中提及的生物反应器是指这样的公开的3D反应器，其中可以在所选的环境和操作条件下实施生物和/或生化过程。这包括以下一项或多项的控制：空隙的几何形状/大小，空隙之间的相互连接的孔径以及包括的空隙的总数(确定生物反应器的整体尺寸)。另外，可以选择性地控制表面涂层、流过生物反应器内的空隙的流动特性、pH、温度、压力、氧气、营养物供应和/或废物去除。临床剂量要求是指提供109个细胞或更多的剂量的能力。3D生物反应器的首选固定床10在图1中一般性地以剖视图示出，其显示了优选的经填充的和球形的空隙结构及其在球形空隙之间的相互连接的孔的实例。更具体地，生物反应器包含连续的相互连接的3D表面区域12，其提供了在抗体存在的情况下结合细胞的能力，并且还在生物反应器内限定了多个相互连接的非随机空隙14，如图所示的，其优选为具有内部凹面的球形以最大化表面与体积的比率。空隙被理解为一定体积的开放空间。在提及非随机时，应理解，如今能够识别出3D生物反应器中的目标或所选数量的空隙，其导致所需公差的实际重复空隙大小和/或几何形状。在提及连续表面时，应理解，扩增的细胞能够容易地从一个表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于T细胞扩增的方法，其包括：/n提供3D生物反应器，所述3D生物反应器包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D>d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的所选空隙体积(V)；并且(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；/n提供在所述生物反应器的用于细胞扩增的表面区域上的聚多巴胺涂层；/n提供附着于所述聚多巴胺涂层的四聚体蛋白；/n提供固定在所述四聚体蛋白上的一种或多种生物素化抗体；/n使T细胞流过具有T细胞受体的所述生物反应器并被活化，其中所述T细胞受体与所述一种或多种生物素化抗体结合；/n将活化的T细胞暴露于含有信号传导分子的灌注培养基中以促进T细胞扩增。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180404 US 15/945,0001.一种用于T细胞扩增的方法，其包括：
提供3D生物反应器，所述3D生物反应器包含具有用于细胞扩增的表面区域的多个空隙，所述多个空隙具有直径D，在所述空隙之间的多个孔开口具有直径d，使得D>d，并且其中：(a)90％或更多的所述空隙具有变化不超过+/-10.0％的所选空隙体积(V)；并且(b)所述空隙之间的90％或更多的所述孔开口具有变化不超过+/-10.0％的d值；
提供在所述生物反应器的用于细胞扩增的表面区域上的聚多巴胺涂层；
提供附着于所述聚多巴胺涂层的四聚体蛋白；
提供固定在所述四聚体蛋白上的一种或多种生物素化抗体；
使T细胞流过具有T细胞受体的所述生物反应器并被活化，其中所述T细胞受体与所述一种或多种生物素化抗体结合；
将活化的T细胞暴露于含有信号传导分子的灌注培养基中以促进T细胞扩增。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述四聚体蛋白包括抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物素化抗体包括抗CD3抗体。


4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物素化抗体包括抗CD3抗体和抗CD28抗体。


5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物素化抗体包括抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗CD2抗体。


6.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号传导分子包括细胞因子信号传导分子。


7.根据权利要求1所述的方法，其中所述空隙的直径(D)大于0.4mm，并且所述孔的直径(d)大于0.20mm。


8.根据权利要求1所述的方法，其中所述空隙的直径(D)在大于0.4mm至100.0mm的范围内。


9.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·凌，
申请(专利权)人：西南研究院，
类型：发明
国别省市：美国;US