一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用制造技术

一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用，本发明专利技术的乳胶微球免疫层析试纸条通过优化乳胶微球抗体探针的制备，有效提高其检测鸡蛋样品的灵敏度，在保证产品灵敏度的前提下减少抗原、抗体的使用量，缩减检测耗时；通过调节样品垫配方以适应鸡蛋样品的检测要求，精简样品前处理步骤，仅通过一次提取吹干并复溶的步骤，即可完成样品前处理的操作；采用本发明专利技术的免疫层析试纸条对鸡蛋样品中残留TYL及TIM的检测，Cut‑Off值均能够达到8ng/g，灵敏度高，检测时间为5min，省时高效。

【技术实现步骤摘要】
一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用
本专利技术涉及检测
，具体地，涉及一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用。
技术介绍
泰乐菌素(Tylosin，TYL)和替米考星(Tilmicosin，TIM)均属于大环内酯类(Macrolides，MALs)药物，是禽畜专用抗生素。因其肠道吸收好，体内扩散快，血药浓度高，在临床上主要用于治疗和预防由支原体、金黄葡萄球菌、化脓杆菌等引起的各种呼吸道、肠道、生殖道和运动系统感染。其生物降解性很差，可以残留在动物食品中，例如牛奶，肉，蛋和蜂蜜等等，如果长期滥用或不合理使用这类药物，易引起过敏反应、听力减退，甚至肝肾的严重损害，对消费者健康造成威胁。根据我国发布国家标准GB31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》中规定，两种药物在产蛋期均不可使用，因此作为一种高灵敏度的快速检测方法对于大量样品现场检测有着重要意义。目前，国内外针对泰乐菌素和替米考星的检测方法有多种，包括含高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)在内的仪器分析方法、微生物法以及免疫分析法等等。仪器方法灵敏度高，特异性强，但需要昂贵的设备、专业的操作人员和繁琐的样品前处理，不适合大量样本的快速筛查；而免疫分析方法以其快速简单、成本低、灵敏度高、适合实际生产中现场监控及大规模样本筛查等优势，在食品中药物残留检测领域发展迅速。其中，免疫检测法目前应用最广泛的包括酶联免疫检测法(ELISA)以及免疫层析法(LFIAs)等。免疫层析法是将免疫和色谱层析技术相结合的检测方法，以标记物标记的抗体与目标待测物特异性结合为基础并通过标记物信号实现定性或定量的目的。该方法检测时间短，使用方便，前处理简单，且不需要专业培训过的人员即可简单的操作，成本低、携带十分方便，检测效果能满足需求，适合用于食品样品的现场检测。针对TYL、TIM在食品样品中残留免疫层析检测方法主要为胶体金、荧光微球免疫层析法，暂未见关于乳胶微球免疫层析的相关报道，且绝大多数方法的Cut-Off值均较高，检测时间均超过了10min，公开号为CN102590516A的中国专利公开了一种检测TYL、TIL药物残留的免疫胶体金试纸条，可用于肌肉、肝脏和肾脏等组织中TIL、TYL药物残留的检测，但该方法需要通过反复多次提取的样品前处理的方式以达到降低基质效应的目的，前处理步骤较复杂，需多次提取，繁杂耗时，而且目前涉及样品主要包括肌肉、肝脏、蜂蜜以及牛奶等，关于鸡蛋样品中TYL、TIL的检测报道相对较少。因此，亟待开发一种高灵敏、高效、快速、简单的针对鸡蛋样品中TIL、TYL药物残留检测方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条及其制备和应用，本专利技术的乳胶微球免疫层析试纸条通过优化乳胶微球抗体探针的制备，有效提高其检测鸡蛋样品的灵敏度，在保证产品灵敏度的前提下减少抗原、抗体的使用量，缩减检测耗时；通过调节样品垫配方以适应鸡蛋样品的检测要求，精简样品前处理步骤，仅通过一次提取吹干并复溶的步骤，即可完成样品前处理的操作；采用本专利技术的免疫层析试纸条对鸡蛋样品中残留TYL及TIM的检测，Cut-Off值均能够达到8ng/g，灵敏度高，检测时间为5min，省时高效。本专利技术的首要目的是提供一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条。本专利技术的另一目的是提供上述泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条的制备方法。本专利技术的再一目的是提供一种利用上述试纸条检测鸡蛋样品中泰乐菌素及替米考星的方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：本专利技术提供了一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条，是由PVC板、样品垫、NC膜、吸水纸以及乳胶微球样品孔组成，所述乳胶微球样品孔中吸附了标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液；所述标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备包括以下步骤：S1.溶解：向蓝色乳胶微球中加入pH6.0的MES缓冲溶液，制备蓝色乳胶微球溶液；S2.活化：在步骤S1溶液中加入0.5mg/mLEDC溶液、0.5mg/mLNHS溶液；200rpm反应15min，随后在2～4℃下10000～14000rpm，离心10～20min；S3.标记：离心后去除上清液，加入0.01MPB溶液，再加入经0.01MPB稀释的泰乐菌素单克隆抗体溶液，200rpm反应1h；所述PB溶液的pH为7.4；S4.封闭：在步骤S3反应后的溶液中加入20％(w/v)BSA溶液，200rpm反应3h，随后在2～4℃下10000～14000rpm，离心10～20min；S5.复溶：去除上清液，加入复溶液，复溶液为pH7.4的0.02MPB溶液，其中还含有0.5～1％Tween-20、3～5％海藻糖、0.5％BSA、0.3％PVP和0.03％procline-300。本专利技术标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备过程中，通过对活化、标记的pH值及其时间，乳胶微球及抗体用量，抗体稀释液的选择，封闭时间以及抗体探针复溶液的配方优化，有效提高乳胶微球与泰乐菌素单克隆抗体的结合效率，影响标记的乳胶微球抗体探针在试纸条上的释放，通过对特定的抗体探针复溶液，提高标记效率和释放，使抗体探针可以有效与包被原或药物发生反应以提高灵敏度，保证效果的同时减少抗体原材料使用。优选地，步骤S1所述MES缓冲溶液的浓度为0.05M。优选地，步骤S1所述制备的蓝色乳胶微球溶液浓度为5mg/mL。优选地，所述蓝色乳胶微球溶液、EDC溶液、NHS溶液的用量比为1mL：15μL：20μL。优选地，步骤S3所述泰乐菌素单克隆抗体溶液浓度为0.062mg/mL。优选地，步骤S3所述溶解沉淀的PB溶液与泰乐菌素单克隆抗体溶液的用量比为1mL：90μL。本专利技术还提供上述试纸条的制备方法，包含以下步骤：S1.划膜：泰乐菌素抗原TYL-CMO-BSA和羊抗鼠IgG通过pH7.4的0.02MPB溶液稀释，将抗原TYL-CMO-BSA、羊抗鼠IgG划到NC膜上，抗原TYL-CMO-BSA为T线，羊抗鼠IgG为C线，划膜后干燥；S2.样品垫处理：将玻纤膜浸泡于样品垫处理液中，取出至垂直放置无液体滴落，再将其水平放置干燥；所述样品垫处理液为pH8.4的0.05MBBS缓冲液，其中还含有0.1％TritonX-100；S3.试纸条组装：在PVC背板上贴上步骤S1制备的NC膜，PVC板的一端与样品垫重叠1～2mm相连，另一端与吸水纸重叠1～2mm相连，组装好后裁剪、干燥即得；S4.乳胶微球样品孔的制备：将标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液以3μL/孔的用量加入酶标孔中，干燥备用。标记体系是指抗体与乳胶微球的标记过程，其中包括活化、标记的pH值及其时间，乳胶微球及抗体用量，抗体稀释液的选择，封闭时间以及抗体探针复溶液的配方优化。活化的pH值及时间会影本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条，其特征在于，由PVC板、样品垫、NC膜、吸水纸以及乳胶微球样品孔组成，所述乳胶微球样品孔中吸附有由蓝色乳胶微球标记的泰乐菌素单克隆抗体；NC膜上划有泰乐菌素抗原TYL-CMO-BSA和羊抗鼠IgG，抗原TYL-CMO-BSA为T线，羊抗鼠IgG为C线；/n所述蓝色乳胶微球标记的泰乐菌素单克隆抗的制备包括以下步骤：/nS1.溶解：向蓝色乳胶微球中加入pH为5～6.5的MES缓冲溶液，制备蓝色乳胶微球溶液；/nS2.活化：在步骤S1溶液中加入0.5mg/mL EDC溶液、0.5mg/mL NHS溶液；200rpm反应15min，随后在2～4℃下10000～14000rpm/min，离心10～20min；/nS3.标记：将离心后的沉淀溶解至0.01M PB溶液中，再加入经0.01M PB稀释的泰乐菌素单克隆抗体溶液，200rpm反应1h；所述PB溶液的pH为7.4；/nS4.封闭：在步骤S3反应后的溶液中加入20％(w/v)BSA溶液，200rpm反应3h，随后在2～4℃下10000～14000rpm/min，离心10～20min；/nS5.复溶：去除上清液，加入复溶液，复溶液为pH 7.4的0.02M PB溶液，其中还含有0.5～1％Tween-20、3～5％海藻糖、0.5％BSA、0.3％PVP和0.03％procline-300。/n...

【技术特征摘要】
1.一种泰乐菌素及替米考星乳胶微球免疫层析试纸条，其特征在于，由PVC板、样品垫、NC膜、吸水纸以及乳胶微球样品孔组成，所述乳胶微球样品孔中吸附有由蓝色乳胶微球标记的泰乐菌素单克隆抗体；NC膜上划有泰乐菌素抗原TYL-CMO-BSA和羊抗鼠IgG，抗原TYL-CMO-BSA为T线，羊抗鼠IgG为C线；
所述蓝色乳胶微球标记的泰乐菌素单克隆抗的制备包括以下步骤：
S1.溶解：向蓝色乳胶微球中加入pH为5～6.5的MES缓冲溶液，制备蓝色乳胶微球溶液；
S2.活化：在步骤S1溶液中加入0.5mg/mLEDC溶液、0.5mg/mLNHS溶液；200rpm反应15min，随后在2～4℃下10000～14000rpm/min，离心10～20min；
S3.标记：将离心后的沉淀溶解至0.01MPB溶液中，再加入经0.01MPB稀释的泰乐菌素单克隆抗体溶液，200rpm反应1h；所述PB溶液的pH为7.4；
S4.封闭：在步骤S3反应后的溶液中加入20％(w/v)BSA溶液，200rpm反应3h，随后在2～4℃下10000～14000rpm/min，离心10～20min；
S5.复溶：去除上清液，加入复溶液，复溶液为pH7.4的0.02MPB溶液，其中还含有0.5～1％Tween-20、3～5％海藻糖、0.5％BSA、0.3％PVP和0.03％procline-300。


2.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备中，步骤S1所述MES缓冲溶液的浓度为0.05M，pH6.0。


3.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备中，步骤S1所述制备的蓝色乳胶微球溶液浓度为5mg/mL。


4.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述蓝色乳胶微球溶液、EDC溶液、NHS溶液的用量比为1mL：15μL：20μL。


5.根据权利要求1所述试纸条，其特征在于，所述标记泰乐菌素单克隆抗体的蓝色乳胶微球溶液的制备中，步骤S...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷红涛，吴欣泽，李向梅，王锦，沈兴，徐振林，孙远明，沈玉栋，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44