一种用于生产羟基酪醇的工程菌制造技术

本发明专利技术公开了一种用于生产羟基酪醇的工程菌，该工程菌同时表达将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶以及将NAD

【技术实现步骤摘要】
一种用于生产羟基酪醇的工程菌
本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种用于生产羟基酪醇的工程菌。
技术介绍
羟基酪醇(hydroxytyrosol，HT)，中文别名：3，4-二羟基苯乙基醇。分子式：C8H10O3，分子量：154.1632。羟基酪醇是一种天然的具有脂溶性、水溶性以及生物活性的多酚类化合物，它主要是以酯化物橄榄苦苷的形式存在于橄榄的各个部位，橄榄苦苷经过水解后可得到游离的羟基酪醇。研究表明：羟基酪醇是迄今发现的最强天然抗氧化剂，对人体健康大有益处，例如癌症化学预防、抗动脉粥样硬化、抑制DNA氧化损伤、保护皮肤光损伤以及抗炎等活性，近年来深受生物和医学界的重视。国外已经相继有羟基酪醇的胶囊、片剂和粉末产品问世。目前，羟基酪醇主要通过植物提取以及化学合成的方法获得。化学合成羟基酪醇，降解收率较低，反应过程复杂且催化剂昂贵，另外化学试剂毒性大、环境污染严重，不适用于工业化生产。目前市场上用在食品添加剂和保健品中的羟基酪醇主要是通过植物提取的方式得到，例如，中国专利技术专利申请CN20161083391.5公开了一种橄榄叶羟基酪醇的提取方法，中国专利技术专利申请CN201710195462.7专利技术了从橄榄叶中提取羟基酪醇的方法，但是植物提取受到植物资源及含量的限制，导致价格昂贵，无法大规模应用。同上述植物提取以及化学合成获得羟基酪醇的方法相比，利用生物法合成羟基酪醇的途径具有稳定、安全、无污染、成本低等优点。因此，通过使用合成生物学技术，在工程微生物中构建全新的生物合成通路，实现羟基酪醇的生物合成得到了广泛的关注。目前已有部分报道使用微生物法生产羟基酪醇。中国专利技术专利申请CN201510242626.8公开了一种大肠杆菌中过表达来源于大肠杆菌的单加氧酶基因簇HpaBC，以葡萄糖为底物从头开始合成羟基酪醇，由于羟基酪醇对基因的毒性，最终羟基酪醇的产量为349.05mg/L产率仅为0.017mol/mol。2012年SatohY等人，提出以酪氨酸为底物，在酪氨酸羟化酶、L-多巴脱羧酶、酪胺氧化酶的共同作用下代谢合成羟基酪醇(Engineeringofl-tyrosineoxidationinEscherichiacoliandmicrobialproductionofhydroxytyrosol[J].Metabolicengineering,2012,14(6).)。该方法中，1mM酪氨酸(0.18g/L)仅产生0.19mM(0.029g/L)羟基酪醇，产率为19％；1mML-DOPA(0.19g/L)仅产生0.74mM(0.11g/L)羟基酪醇，产率为74％。并且在大肠杆菌宿主菌中表达的关键基因主要来源于小鼠和人，存在异源宿主表达不兼容的情况，所以底物利用率低，很难实现工业化生产。中国专利技术专利申请CN107586794A公开了一种大肠杆菌异源代谢生产酪醇或羟基酪醇的方法。该方案在宿主中高效表达了氨基转移酶(Aminotransferase)，酮酸脱羧酶(Ketoaciddecarboxylase)，醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase)来生产酪醇，然后在4-羟基苯乙酸羟化酶的作用下来生产羟基酪醇。该方案以6g/L(33mM)酪氨酸为底物时，羟基酪醇产量能达到1243±165mg/L(8mM)，产率仅为0.24mol/mol，该方案的缺点是需要外加许多昂贵的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)和还原型辅酶Ⅰ(NADH)，而且在苯环上加羟基的效率明显降低，致使羟基酪醇的得率很低，中间代谢产物酪醇大量积累。基于目前各种方法的缺陷，研究一种可工业化生产羟基酪醇的工程菌显得尤为必要。
技术实现思路
本专利技术提供了一种用于生产羟基酪醇的工程菌，该工程菌能够生产高产量以及高产率的羟基酪醇，具有良好的工业化应用前景。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术提供了一种用于生产羟基酪醇的工程菌，所述工程菌表达将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶以及将NAD+还原生成NADH的辅酶。在本专利技术的一些实施方案中，所述将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶为酪氨酸酶或4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)。在本专利技术的一些实施方案中，所述将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶为酪氨酸酶。在本专利技术的一些实施方案中，所述酪氨酸酶来源于嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia(smtyrosinase)、巨大芽孢杆菌Bacillusmegaterium(bmtyrosinase)、苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis(bttyrosinase)、内生芽胞杆菌Bacillusendophyticus(betyrosinase)、蔷薇双壳菌Diplocarponrosae(drtyrosinase)或青枯雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum(rstyrosinase)。在本专利技术的一些实施方案中，所述betyrosinase的氨基酸序列为NCBI上accessionNO.为WP_063592733.1。在本专利技术的一些实施方案中，所述drtyrosinase的氨基酸序列为NCBI上accessionNO.为PBP28426.1。在本专利技术的一些实施方案中，所述smtyrosinase的氨基酸序列为NCBI上accessionNO.为AAC16658.1，编码smtyrosinase的核苷酸序列为SEQIDNO:5。在本专利技术的一些实施方案中，所述bmtyrosinase的氨基酸序列为NCBI上accessionNO.为ACC86108.1，编码bmtyrosinase的核苷酸序列为SEQIDNO:4。在本专利技术的一些实施方案中，所述bttyrosinase的氨基酸序列为NCBI上accessionNO.为AAR88107.1，编码bttyrosinase的核苷酸序列为SEQIDNO:6。在本专利技术的一些实施方案中，所述rstyrosinase的氨基酸序列为NCBI上accessionNO.为AFR68815.1，编码rstyrosinase的核苷酸序列为SEQIDNO:7。在本专利技术的一些实施方案中，所述将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶为HpaBC，HpaBC和可将NAD+还原成NADH的辅酶构成了NAD辅酶循环再生体系。在本专利技术的一些实施方案中，所述HpaBC来源于大肠杆菌BL21(DE3)(ecHpaBC)或绿脓假单胞杆菌PseudomonasaeruginosaBAR65782(paHpaBC)。在本专利技术的一些实施方案中，所述来源于ecHpaBC的核苷酸序列为NCBI上accessionNO.为NC_012892REGION:4498782..4500874；所述来源于paHpaBC的核苷酸序列为SEQIDNO：3。在本专利技术的一些实施方案中，所述将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶来源于天然的或经蛋白质工程改造的微生物，例如来源于细菌或真菌。在本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于生产羟基酪醇的工程菌，其特征在于，所述工程菌表达将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶以及将NAD

【技术特征摘要】
1.一种用于生产羟基酪醇的工程菌，其特征在于，所述工程菌表达将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶以及将NAD+还原生成NADH的辅酶。


2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶为酪氨酸酶或4-羟基苯乙酸3-单加氧酶。


3.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶为酪氨酸酶。


4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述酪氨酸酶来源于嗜麦芽窄食单胞菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、内生芽胞杆菌、蔷薇双壳菌或青枯雷尔氏菌。


5.如权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶为4-羟基苯乙酸3-单加氧酶。


6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶来源于大肠杆菌或绿脓假单胞杆菌。


7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶来源于大肠杆菌。


8.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述将NAD+还原生成NADH的辅酶为甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶或亚磷酸脱氢酶。


9.如权利要求8所述的工程菌，其特征在于，所述将NAD+还原生成NADH的辅酶为甲酸脱氢酶或醇脱氢酶。


10.如权利要求9所述的工程菌，其特征在于，所述将NAD+还原生成NADH的辅酶为甲酸脱氢酶。


11.如权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述甲酸脱氢酶来源于博伊丁假丝酵母、酿酒酵母或胞内分枝杆菌。


12.如权利要求11所述的工程菌，其特征在于，所述甲酸脱氢酶来源于胞内分枝杆菌。


13.如权利要求12所述的工程菌，其特征在于，所述编码来源于胞内分枝杆菌的甲酸脱氢酶的核苷酸序列为SEQIDNO：10。


14.如权利要求9所述的工程菌，其特征在于，所述醇脱氢酶来源于短乳杆菌。


15.如权利要求14所述的工程菌，其特征在于，所述编码来源于短乳杆菌的醇脱氢酶的核苷酸序列为SEQIDNO：11。


16.一种用于生产羟基酪醇的工程菌，其特征在于，所述工程菌是通过将pETDuet-1质粒转化到宿主大肠杆菌BL21(DE3)中得到的，所述pETDuet-1质粒装载将酪醇催化生成羟基酪醇的羟化酶基因以及将NAD+还原生成NADH的辅酶基因。
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵华，张婷，宋田青，蒋发现，
申请(专利权)人：枫杨生物研发南京有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32