【技术实现步骤摘要】
一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用
本专利技术属于基因工程
,具体涉及一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法和应用。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。化学农药污染严重,不可持续发展,生物农药是一类很好的替代品,与化学农药相比,生物农药具有毒性低、对环境友好和不易产生抗药性等明显优势,已经吸引了越来越多学者的关注并逐渐应用到生物防治实践当中。其中,上海交通大学许煜泉课题组率先利用铜绿假单胞菌株M18开发出了具有广谱、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和茎腐的生物农药吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid,简称PCA,CAS号为2538-68-3),定名为“申嗪霉素”,主要用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、黄瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等,并获得了农业部颁发的新农药药证。但最近相关研究发现,与PCA相比,另一种吩嗪类抗生素吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,PCN)具有更好的安全性、稳定性及对植物病原菌的抑菌活性,在防治水稻纹枯病和小麦赤霉病等方面具有重要的应用价值。目前PCN生产方法虽有化工方法,但条件苛刻,并且向环境释放有毒有害物质,所以主要由假单胞菌中的铜绿假单胞菌生产,但专利技术人发现,铜绿假单胞菌则是目前医院中一种比较常见的机会致病菌,并不太适合作为生 ...
【技术保护点】
1.一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株,其特征在于,将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个即得;/n其中,所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1已送至中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2020年05月08日,保藏编号为CCTCC NO:M 2020108。/n
【技术特征摘要】
1.一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株,其特征在于,将绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个即得;
其中,所述绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1已送至中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2020年05月08日,保藏编号为CCTCCNO:M2020108。
2.如权利要求1所述的基因工程菌株,其特征在于,所述phzO基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示;
所述外源phzH基因碱基序列如SEQIDNO.2所示;
所述lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的碱基序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示。
3.权利要求1或2所述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法,其特征在于,所述方法包括:
将绿针假单胞菌Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因,然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因中的一个或多个。
4.如权利要求3所述的构建方法,其特征在于,“所述phzO基因替换为外源的phzH基因”的具体步骤包括:敲除phzO基因后得菌株QPCA-1,然后将外源phzH基因导入菌株QPCA-1中。
5.如权利要求4所述的构建方法,其特征在于,所述敲除phzO基因步骤包括:
i、扩增phzO基因片段的上下游同源臂;采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得phzO基因重组质粒;
ii、将phzO基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与绿针假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养,从而将phzO基因重组质粒导入绿针假单胞菌Qlu-1;
iii、筛选阳性克隆,即得菌株QPCA-1。
6.如权利要求5所述的构建方法,其特征在于,扩增phzO基因片段上游同源臂的引物包括phzO-F1和phzO-R1,序列分别如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示;
扩增phzO基因片段下游同源臂的引物包括phzO-F2和phzO-R2,序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示;
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的phzO基因上下游融合片段序列如SEQIDNO.12所示;
筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。
7.如权利要求4所述的构建方法,其特征在于,所述外源phzH基因导入菌株QPCA-1中具体方法为:
i、以QPCA-1基因组为模板,以phzO-F1/phzO-R1-2,phzO-F2-2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2;以合成的phzH基因为模板,phzH-F1/phzH-R1为引物扩增片段phzH-2;以phzO-U2、phzO-D2、phzH-2为模板,以phzO-F1/phzO-R2为引物,扩增融合phzO基因上下游的phzH导入片段phzH-IN;将融合片段phzH-IN插入pK18mobsacB质粒中得phzH基因重组质粒;
ii、将phzH基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与菌株QPCA-1进行双亲杂交培养,从而将phzH基因重组质粒导入菌株QPCA-1;
ii...
【专利技术属性】
技术研发人员:刘开泉,王瑞明,宿春丽,李玲,王腾飞,
申请(专利权)人:齐鲁工业大学,
类型:发明
国别省市:山东;37
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