用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供一株用于生产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途，属于基因工程技术领域。本发明专利技术是以绿针假单胞菌Qlu‑1为出发菌株，通过基因工程技术从Qlu‑1菌株基因组中phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因，同时导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因，并敲除pykF基因，通过构建相应基因工程菌株，使得吩嗪‑1‑甲酰胺的产量大幅提高。其中，基因工程菌株QPCN‑8具有最佳效果，其PCN产量高达10378.5mg/L，同时生长性能良好，因此具有良好的实际应用之价值。

【技术实现步骤摘要】
用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途
本专利技术属于基因工程
，具体涉及用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途。
技术介绍
公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。吩嗪衍生物是一类含氮杂环化合物，通常颜色各异，以橙色或黄色为主，也有绿色、红色等，侧链取代基的不同决定了吩嗪颜色的不同，而结构上的差异同时决定了各自不同的物理属性以及抑制病原菌的生物活性。目前自然界已经发现了多种具有相似基本结构的吩嗪类化合物，有些产吩嗪的菌株能同时产生好几种不同的吩嗪衍生物，而几乎所有的吩嗪化合物对细菌和真菌都有生物活性。假单胞菌产生的吩嗪类抗生素包括绿脓菌素(pyocyanin，PYO)和吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)、吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxilicacid,PCA)、1-羟基吩嗪(1-hydroxyphenazine，1-OH-PHZ)、2-羟基吩嗪(2-hydroxyphenazine，2-OH-PHZ)等。其中，PCN不仅具有良好的生防功能，同时还具有抗肿瘤等生物医药功能，有比较好的应用前景。目前，吩嗪-1-甲酰胺生产方法虽有化工方法，但条件苛刻，并且向环境释放有毒有害物质，所以主要由假单胞菌中的铜绿假单胞菌生产，但专利技术人发现，铜绿假单胞菌则是目前医院中一种比较常见的机会致病菌，并不太适合作为生产菌株来推广应用。
技术实现思路
为了克服上述技术问题，本专利技术提供用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌及其制备方法和用途。本专利技术以相对安全的绿针假单胞菌为出发菌株，通过基因工程技术在其基因组上敲除具有负调控作用的双元调控相关基因，并通过增强莽草酸的利用提高PCN产量，最终制备得到的基因工程菌其PCN产量高达10378.5mg/L，具有良好的实际应用之价值。为实现上述技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个方面，提供一株用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌，具体是将绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，并敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因；然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因，敲除pykF基因即得。其中，所述绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1是一株筛选自中国潍坊蔬菜大棚菜椒根际的绿针假单胞菌，经测序得知含有phzABCDEFG基因簇，以及吩嗪类的修饰基因phzO，可以产生吩嗪-1-羧酸以及2-羟基吩嗪。该菌株已送至中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2020年05月08日，保藏编号为CCTCCNO：M2020108。本专利技术的第二个方面，提供上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的制备方法，所述方法包括：将绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因；然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因，并敲除pykF基因即得。本专利技术的第三个方面，提供上述基因工程菌株在生产吩嗪-1-甲酰胺中的应用。本专利技术的第四个方面，提供一种吩嗪-1-甲酰胺的生产方法，所述方法包括：将上述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株接种于发酵培养基中进行培养。上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：上述技术方案是以绿针假单胞菌Qlu-1为出发菌株，通过基因工程技术从Qlu-1菌株基因组中phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因，同时导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因，并敲除pykF基因，通过构建相应基因工程菌株，使得吩嗪-1-甲酰胺的产量大幅提高，能够更加有效用于生物防治。其中，基因工程菌株QPCN-8具有最佳效果，其PCN产量高达10378.5mg/L，同时生长性能良好，因此具有良好的实际应用之价值。附图说明构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。图1为本专利技术实施例中突变质粒pK18-rpeA-ud构建电泳图；(A)rpeA上下游同源臂的扩增：1，DNALadder；2，rpeA上游同源臂扩增；3，rpeA下游同源臂扩增；(B)rpeA上游同源臂融合片段扩增：1，DNALadder；2，3rpeA基因上下游臂融合片段；图2为本专利技术实施例中rpeA基因双亲杂交双抗性平板筛选图；图3为本专利技术实施例中影印法筛选rpeA基因双交换阳性单克隆；图4为本专利技术实施例中rpeA敲除株PCR验证图；外部引物检测：1，空白对照；2，DNALadder；3，野生株Qlu-1基因组为模板扩增片段；4，rpeA敲除株基因组为模板扩增片段；内部引物检测：1，野生株Qlu-1基因组为模板扩增片段；2，DNALadder；3，rpeA敲除株基因组为模板扩增片段；4，空白对照；图5为本专利技术实施例中QPCN-1产物NMR碳谱鉴定图；图6为本专利技术实施例中QPCN-1产物NMR氢谱鉴定图；图7为本专利技术实施例中不同菌株PCN产量图；图8为本专利技术实施例中模块质粒pBbB8K-GFP多基因组装原理图；图9为本专利技术实施例中多基因顺序图；图10为本专利技术实施例中pykF基因敲除模式图；图11为本专利技术实施例中不同菌株PCN产量图。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本专利技术的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本专利技术实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本专利技术的保护范围。本专利技术的一个典型具体实施方式中，提供一株用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌，具体是将绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌，其特征在于，具体是将绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，并敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因；然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因，敲除pykF基因即得；/n其中，所述绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)Qlu-1已送至中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年05月08日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020108。/n

【技术特征摘要】
1.一株生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌，其特征在于，具体是将绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，并敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因；然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因，敲除pykF基因即得；
其中，所述绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)Qlu-1已送至中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年05月08日，保藏编号为CCTCCNO：M2020108。


2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述phzO基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示；
所述外源phzH基因碱基序列如SEQIDNO.2所示；
所述lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的碱基序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.7所示；
所述phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因的碱基序列分别如SEQIDNO.43、SEQIDNO.44、SEQIDNO.45、SEQIDNO.46、SEQIDNO.47和SEQIDNO.48所示；
所述pykF基因的碱基序列如SEQIDNO.49所示。


3.权利要求1或2所述生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将绿针假单胞菌Qlu-1及其衍生物基因组中的phzO基因替换为外源的phzH基因，然后再敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因；然后导入phzC基因、aroB基因、aroD基因、aroE基因、tktA基因和ppsA基因，敲除pykF基因即得。


4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，“所述phzO基因替换为外源的phzH基因”的具体步骤包括：敲除phzO基因后得菌株QPCA-1，然后将外源phzH基因导入菌株QPCA-1中。


5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述敲除phzO基因步骤包括：
i、扩增phzO基因片段的上下游同源臂；采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得phzO基因重组质粒；
ii、将phzO基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与绿针假单胞菌Qlu-1进行双亲杂交培养，从而将phzO基因重组质粒导入绿针假单胞菌Qlu-1；
iii、筛选阳性克隆，即得菌株QPCA-1。


6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，扩增phzO基因片段上游同源臂的引物包括phzO-F1和phzO-R1，序列分别如SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示；
扩增phzO基因片段下游同源臂的引物包括phzO-F2和phzO-R2，序列分别如SEQIDNO.10和SEQIDNO.11所示；
采用融合PCR法连接上下游同源臂获得的phzO基因上下游融合片段序列如SEQIDNO.12所示；
筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。


7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述外源phzH基因导入菌株QPCA-1中具体方法为：
i、以QPCA-1基因组为模板，以phzO-F1/phzO-R1-2，phzO-F2-2/phzO-R2分别为引物扩增phzO基因的上游片段phzO-U2及下游片段phzO-D2；以合成的phzH基因为模板，phzH-F1/phzH-R1为引物扩增片段phzH-2；以phzO-U2、phzO-D2、phzH-2为模板，以phzO-F1/phzO-R2为引物，扩增融合phzO基因上下游的phzH导入片段phzH-IN；将融合片段phzH-IN插入pK18mobsacB质粒中得phzH基因重组质粒；
ii、将phzH基因重组质粒导入大肠杆菌S17-1(λ)后与菌株QPCA-1进行双亲杂交培养，从而将phzH基因重组质粒导入菌株QPCA-1；
iii、筛选阳性克隆，即得；
优选的，
phzO-F1和phzO-R1-2的序列分别如SEQIDNO.8和SEQIDNO.13所示；
phzO-F2-2和phzO-R2的序列分别如SEQIDNO.14和SEQIDNO.11所示；
phzH-F1和phzH-R1的序列分别如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示；
phzH-IN基因上下游融合片段的序列如SEQIDNO.17所示；
筛选阳性克隆的方法具体包括蔗糖平板筛选、影印筛选和PCR筛选。


8.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，敲除lon基因、rsmE基因、psrA基因、parS基因和rpeA基因的方法与敲除phzO基因的方法相同；
其中，敲除lon基因方法中，
扩增lon基因片段上游同源臂的引物包括lon-F1和lon-R1，序列分别如SEQIDNO.18和SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘开泉，王瑞明，李玲，王腾飞，李丕武，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37