高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法技术

本发明专利技术提供一类高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法，所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌包括J1‑019‑A菌株、过表达spnJ或过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌；所述J1‑019‑A菌株为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌的基因组上敲除了与多杀合成不相关的聚酮合酶基因簇，并引入了可以后续进行方便改造的attB位点，所述过表达spnJ或过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnJ或过表达spnP。本发明专利技术提供的多杀菌素生产菌株经过发酵罐的放大发酵，可实现多杀菌素的发酵生产，可以达到工业化生产的潜力。

【技术实现步骤摘要】
高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法。
技术介绍
多杀菌素(Spinosad)是由放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)经有氧发酵产生的一种大环内酯类生物杀虫剂，由于多杀菌素具有快速、高效、低残留、对哺乳动物和鸟类无毒性等优点，该杀虫剂已在多个国家批准注册并使用，并且获得了美国“总统绿色化学品挑战奖”。但是，目前在很多国家尚不具备发酵生产多杀菌素的能力，主要原因是该菌株的发酵周期较长，发酵产量低，所以产业化实施较为困难。目前，利用生物技术改造发酵菌株提升产量，使其发酵更为容易是一种常见的方案。然而，虽然该菌株的野生型改造较为容易，目前也有报道对该菌株的野生型菌株进行改造，但由于野生型菌株的发酵产量非常低，因此改造后即使产量提升也很难应用于工业化生产。而对于经过多轮诱变的刺糖多孢菌的生产菌株，其遗传操作几乎不可行，因此多杀菌株的产业化严重受阻，急需对多杀菌素高产菌株进行遗传改造并提升其产量，使其能够加速多杀菌素发酵产业化进程。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一类高产多杀菌素的刺糖多孢菌及提高菌株多杀菌素产量的方法，包括在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌的基因组上敲除了与多杀合成不相关的聚酮合酶基因簇，并引入了可以后续进行方便改造的attB位点得到的J1-019-A菌株，以及在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnJ或spnP得到的菌株。本专利技术首次报道可以在诱变后刺糖多孢菌菌株中插入attB位点，后续可以进行多次改造，最终提高多杀菌素的产量，达到进行工业化生产的潜力。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术第一方面提供一类高产多杀菌素的刺糖多孢菌，包括J1-019-A菌株、过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌及过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌；所述J1-019-A菌株是指在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌的基因组上敲除了与多杀菌素合成不相关的聚酮合酶基因簇，并引入了可以后续进行方便改造的attB位点。所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌是指在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnJ。所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌是指在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnP。其中，所述spnJ基因为多杀菌素生物合成途径中的黄素依赖型氧化酶基因,其编码蛋白催化反应如下式I，其中，R为-H或-CH3。所述spnP基因为多杀菌素生物合成途径中的福乐糖胺转移酶基因,其编码蛋白催化反应如下式II，其中，R为-H或-CH3。进一步地，所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌，是采用强启动子ermEp或其他启动子过表达spnJ。优选地，所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌采用强启动子ermEp过表达spnJ，其多杀菌素产量达到1934.97mg/L及以上，产量提高26.33％及以上。进一步地，所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌，采用强启动子ermEp或其他启动子过表达spnP。优选地，所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌采用强启动子ermEp过表达spnP，其多杀菌素产量达到2050.32mg/L及以上，产量提高33.86％及以上。本专利技术第二方面提供一种提高上述产多杀菌素的刺糖多孢菌的多杀菌素产量的方法，将所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌进行不断划线传代，挑选单菌落进行发酵，从中选取产量高的菌株进一步进行传代，进而进一步提升所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌的多杀菌素产量。所述高产多杀菌素的刺糖多孢菌通过上述方法，再经发酵罐的放大发酵，能够实现多杀菌素的发酵生产。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术提供的多杀菌素生产菌株的产量在摇瓶产量即可达到2050.32mg/L,该产量是目前最有望实现工业化生产的产量。目前大部分已经实现工业化发酵的放线菌的菌株在摇瓶产量为1-2g/L,比如纳他霉素生产菌株，马度米星生产菌株等。因此，可以预见，目前本专利技术提供的多杀菌素生产菌株经过发酵罐的放大发酵，可实现多杀菌素的发酵生产。本专利技术通过5000余次尝试选，最终利用自杀型质粒在多轮诱变后的菌株J1-019中导入了attB位点，从而使后续改造可以利用attB-attP进行高效整合型改造，使后续更丰富的改造成为可能。目前对于多轮诱变后的多杀菌素高产菌株刺糖多孢菌的遗传操作尚未有报道，在本专利技术中专利技术人通过多次尝试也发现该菌株的改造非常困难。而利用本专利技术构建的J1-019-A菌株可以高效地进行后续改造，使该菌株的改造变为可能。本专利技术利用不断划线优化的方法，将改造后的菌株进行进一步优化稳定，使其产量提升10.95％，为后续多种工程菌株的产量稳定及优化提供了一种可行方案。附图说明图1为本专利技术实施例1中pYX204质粒的构建流程图；图2为本专利技术实施例1中双交换同源重组鉴定图；图中，W为野生型刺糖多孢菌J1-019，D为单交换菌株，S1-S6为筛选的双交换菌株，-为无菌水；图3为本专利技术实施例2中过表达spnJ、spnP菌株发酵结果图。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。首先，专利技术人经过多轮诱变筛选，将野生刺糖多孢菌诱变成为一株较为高产多杀菌素的菌株，将其命名为J1-019。但是由于该菌株经过多轮诱变后，常用的遗传操作方法均不能适用，专利技术人曾经多次尝试用遗传不稳定型载体，比如遗传不稳定型质粒pJTU1278以及温敏型质粒pKC1139均不能成功进行接合转移，且发现诱变后的菌株中不含常用的染色体整合的attB位点。因此专利技术人首先在野生型菌株J1-019导入phiC31attB位点基因片段，同时敲除了一部分与多杀菌素生物合成无关的聚酮合酶基因。插入phiC31attB位点的J1-019突变株(命名为J1-019-A)，在特异性位点整合酶的帮助下，可利用attB-attP位点整合的原理进行遗传操作改造。与野生型菌株1258.3mg/L相比，J1-019-A的多杀菌素产量最高达到1380.5mg/L，产量提高9.71％。通过不断划线传代将该菌株发酵能力进行进一步提升，最终达到1531.70mg/L。接着，选用ermEp高强度的启动子对编码单功能黄素依赖型氧化酶spnJ基因以及福乐糖胺转移酶spnP进行了过表达，结果表明与起始菌株J1-019-A多杀菌素产量1531.70mg/L相比，用强启动子ermEp过表达spnJ基因多杀菌素最高产量达到1934.97mg/L，产量提高26.33％；用强启动子ermEp过表达spnP基因多杀菌素最高产量达到2050.32mg/L，产量提高33.86％。实施例1野生型菌株J1-019中插入phiC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一类高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：包括J1-019-A菌株、过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌及过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌；所述J1-019-A菌株为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌的基因组上敲除了与多杀合成不相关的聚酮合酶基因簇，并引入了可以后续进行方便改造的attB位点，所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnJ，所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnP。/n

【技术特征摘要】
1.一类高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：包括J1-019-A菌株、过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌及过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌；所述J1-019-A菌株为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌的基因组上敲除了与多杀合成不相关的聚酮合酶基因簇，并引入了可以后续进行方便改造的attB位点，所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnJ，所述过表达spnP的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌为在原多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌中过表达spnP。


2.如权利要求1所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌，采用强启动子ermEp或其他启动子过表达spnJ。


3.如权利要求1或2所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：所述spnJ为多杀菌素生物合成途径中的黄素依赖型氧化酶基因,其编码蛋白催化反应如下式I，



其中，R为-H或-CH3。


4.如权利要求1或2所述的高产多杀菌素的刺糖多孢菌，其特征在于：所述过表达spnJ的多杀菌素生产菌株刺糖多孢菌采用强启动子ermEp过表达spnJ，其多杀菌素产量达到19...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天罡，刘然，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42