一种生产羟基酪醇的工程菌制造技术

本发明专利技术提供了一种生产羟基酪醇的工程菌以及通过该工程菌生产羟基酪醇的方法，利用该工程菌催化酪氨酸通过双路径生产羟基酪醇，可在较高底物浓度的基础上，得到高产率和高产量的羟基酪醇。同时，本发明专利技术制备方法简单且原料易得，价格更加低廉，具有良好的工业化应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种生产羟基酪醇的工程菌
本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种生产羟基酪醇的大肠杆菌工程菌。
技术介绍
羟基酪醇(Hydroxytyrosol，HT)，化学名为3，4-二羟基苯乙醇，是在橄榄油中发现的最强大的抗氧化剂之一，比白藜芦醇具有更强的氧自由基吸收能力，表现出多种生物活性。已有研究表明其在抗肿瘤，抗血栓，调血脂和抗动脉硬化，抗病原微生物，防治视网膜黄斑变性，保护软骨和抗骨质疏松等多方面具有药理作用，在医药，保健食品，化妆品和食品添加剂等领域有着广阔的应用前景和开发潜力。当前，羟基酪醇的合成方法主要包括植物提取，化学合成，以及生物合成。在自然资源中，HT主要以酯的形式广泛存在于橄榄植物中。从新鲜的橄榄叶、橄榄花或橄榄油厂废水中提取为当前市场上的主要生产方式，中国专利技术专利申请CN201610883391.5公开了一种橄榄叶羟基酪醇的提取工艺；中国专利技术专利申请CN201710195462.7公开了一种从橄榄叶中提取羟基酪醇的方法。提取过程中需要使用强酸性水蒸汽，纯化过程繁琐且费用昂贵，回收率比较低，原材料的来源不稳定，且由于羟基酪醇在植物提取过程中有氧化倾向，植物提取最终获得的产物纯度只能达到20％-40％。化学合成较易获得较高纯度的羟基酪醇产品，例如，CN201110357075.1、CN201210342015.7，但目前已知的化学合成路线中涉及价格昂贵的催化剂，或者反应的步骤较多，此外，有机合成过程中涉及较多有机溶剂和金属氧化物，因此从技术和成本考虑，该方法不适用于工业化生产。因此通过微生物法生产受到了广泛的关注。目前已有部分报道使用微生物法生产羟基酪醇。中国专利技术专利申请CN201510242626.8公开了一种大肠杆菌中过表达来源于大肠杆菌的单加氧酶基因簇HpaBC，以葡萄糖为底物从头开始合成羟基酪醇，由于羟基酪醇对基因的毒性，最终羟基酪醇的产量为349.05mg/L产率仅为0.017mol/mol，从头合成的羟基酪醇产量到菌株自身代谢通量和代谢调节的影响，难以实现高的生产速率和得率。2012年，YasuharuSatoh等人报道使用一株工程大肠杆菌，使用1mM酪氨酸为底物，依次通过酪氨酸羟化酶，L-多巴脱羧酶，酪胺氧化酶，醇脱氢酶作用下生成0.19±0.0056mM羟基酪醇，产率仅为0.19mol/mol，该方法中羟基酪醇的得率较低，中间产物积累较多，且菌株对底物的消耗速率较慢(1mM酪氨酸消耗需要将近72h)。中国专利技术专利申请CN201711054680.5公开了异源代谢途径生产酪醇及羟基酪醇的方法。该方案在宿主中表达了芳香氨基转移酶(aromaticaminotransferase，ArAT)，酮酸脱羧酶(Ketoaciddecarboxylase，KDC)，醇脱氢酶(Alcoholdehydrogenase，ADH)来生产酪醇，再在4-羟基苯乙酸羟化酶的作用下来生产羟基酪醇。从简单碳源出发，羟基酪醇产量能达到647±35mg/L，以6g/L(33mM)酪氨酸为底物时，羟基酪醇产量能达到1243±165mg/L(8mM)，产率仅为0.24mol/mol。该方案的缺点是需要外加许多昂贵的辅酶磷酸吡哆醛(PLP)和还原型辅酶Ⅰ(NADH)。另外，该方案体系中除了目标化合物羟基酪醇的积累，还有L-左旋多巴作为副产物产出，使得羟基酪醇产率较低。现有技术已知羟基酪醇的以葡萄糖为底物从头合成受到菌株自身代谢的影响导致最终产量低(低于1g/L)，耗时长(大于48h)，产率低；以酪氨酸为底物的生物转化方法，因缺乏辅因子再生体系，以及中间产物较多，催化效率随着反应持续导致辅因子不足，难以将更多的底物进行转化，最终导致催化的效率低，产率低。目前底物浓度最高做到为6g/L(33mM)，产率仅有0.24mol/mol。基于目前各种方法的缺陷，研究一种可实现高浓度底物持续性转化，可工业化生产、同时利用廉价底物可以高效生产羟基酪醇的方法非常有必要。
技术实现思路
基于目前各种方法的缺陷，本专利技术提供了一种生产羟基酪醇的工程菌以及利用该工程菌生产羟基酪醇的方法，实现了廉价底物酪氨酸到羟基酪醇的双路径高效生产。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术一方面提供了一种生产羟基酪醇的工程菌，所述大肠杆菌工程菌同时表达6种酶，分别为4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)、甲酸脱氢酶(FDH)、L-α-氨基酸转氨酶(ArAT)、L-谷氨酸脱氢酶(GDH)、α-酮酸脱羧酶(KDC)和醇脱氢酶(ADH)。在本专利技术的一些实施方案中，所述工程菌同时表达的6种酶是通过双质粒共表达编码所述6种酶的基因实现的。在本专利技术的一些实施方案中，所述双质粒为pRSFDuet-1和pETDuet-1。在本专利技术的一些实施方案中，所述pRSFDuet-1装载编码4-羟基苯乙酸3-单加氧酶的基因和编码甲酸脱氢酶的基因；所述pETDuet-1装载编码L-α-氨基酸转氨酶的基因、编码L-谷氨酸脱氢酶的基因、编码α-酮酸脱羧酶的基因和编码醇脱氢酶的基因。在本专利技术的一些实施方案中，所述pETDuet-1装载编码4-羟基苯乙酸3-单加氧酶的基因和编码甲酸脱氢酶的基因；所述pRSFDuet-1装载编码L-α-氨基酸转氨酶的基因、编码L-谷氨酸脱氢酶的基因、编码α-酮酸脱羧酶的基因和编码醇脱氢酶的基因。在本专利技术的一些实施方案中，所述工程菌是通过将pRSFDuet-1和pETDuet-1质粒转化到宿主Escherichiacoli(大肠杆菌)B21感受态细胞中得到的。在本专利技术的一些实施方案中，所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)来自大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)。在本专利技术的一些实施方案中，所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶(HpaBC)的核苷酸序列是NCBI上accessionNO为：NC_001136.10，REGION:complement(1234218..1236125)。在本专利技术的一些实施方案中，所述甲酸脱氢酶来自Mycobacteriumintracellulare胞内分枝杆菌(M.iFDH)。在本专利技术的一些实施方案中，所述甲酸脱氢酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为WP_009957650.1。在本专利技术的一些实施方案中，所述甲酸脱氢酶M.iFDH的氨基酸序列使用在线分析工具http://www.jcat.de/按照大肠杆菌密码子进行核苷酸序列优化，优化后的序列为SEQIDNO:1。在本专利技术的一些实施方案中，所述L-α-氨基酸转氨酶(ArAT)来自大肠杆菌EscherichiacoliBL21(E.cTyrB)或酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY4741(ScARO8)。在本专利技术的一些实施方案中，所述L-α-氨基酸转氨酶的氨基酸序列是NCBI上accessionNO为NP_418478.1、NP_011313.1的序列。在本专利技术的一些实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产羟基酪醇的工程菌，其特征在于，所述工程菌同时表达6种酶，分别为4-羟基苯乙酸3-单加氧酶、甲酸脱氢酶、L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种生产羟基酪醇的工程菌，其特征在于，所述工程菌同时表达6种酶，分别为4-羟基苯乙酸3-单加氧酶、甲酸脱氢酶、L-α-氨基酸转氨酶、L-谷氨酸脱氢酶、α-酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。


2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌同时表达的6种酶是通过双质粒共表达编码所述6种酶的基因实现的。


3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，所述双质粒为pRSFDuet-1和pETDuet-1。


4.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述pRSFDuet-1装载编码4-羟基苯乙酸3-单加氧酶的基因和编码甲酸脱氢酶的基因；所述pETDuet-1装载编码L-α-氨基酸转氨酶的基因、编码L-谷氨酸脱氢酶的基因、编码α-酮酸脱羧酶的基因和编码醇脱氢酶的基因。


5.根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于，所述pETDuet-1装载编码4-羟基苯乙酸3-单加氧酶的基因和编码甲酸脱氢酶的基因；所述pRSFDuet-1装载编码L-α-氨基酸转氨酶的基因、编码L-谷氨酸脱氢酶的基因、编码α-酮酸脱羧酶的基因和编码醇脱氢酶的基因。


6.根据权利要求4或5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌是通过将pRSFDuet-1和pETDuet-1质粒转化到宿主大肠杆菌B21感受态细胞中得到的。


7.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述4-羟基苯乙酸3-单加氧酶来自于大肠杆菌。


8.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述甲...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵华，宋田青，张婷，
申请(专利权)人：枫杨生物研发南京有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32