插入表达调控序列的核酸分子、包含核酸分子的表达载体及其药物用途制造技术

公开了一种作为表达系统的核酸分子，其包括至少一个具有内部核糖体进入位点(IRES)序列的表达控制序列，至少一个编码区，以及任选在至少一个表达控制序列的上游的多个腺苷或胸苷的核酸分子。此外，公开了包括该核酸分子的重组表达载体和该核酸分子的药学或医学用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】插入表达调控序列的核酸分子、包含核酸分子的表达载体及其药物用途
本公开涉及核酸分子，更具体地，涉及增强表达效率的核酸分子，包含该核酸分子的表达载体及其药学用途。
技术介绍
随着生物技术的发展，已经知晓各种表达目的基因(GOI)的表达系统。在表达系统中，基于细胞的表达系统通常使用微生物或真核生物的天然表达机制，而其他表达系统通常使用纯化的RNA聚合酶、核糖体、tRNA和核糖核酸。特别地，源自真核生物的蛋白质执行翻译后修饰，例如磷酸化、甲基化和糖基化。由于微生物不具有这种翻译后修饰机制，因此真核生物表达系统已经在表达真核生物起源的蛋白的情况下使用。真核表达系统可用于基因治疗，其中将具有编码用于治疗各种疾病的肽或蛋白质的可读框(ORF)的GOI插入表达系统中，或用于基因疫苗，其中将具有编码肽或蛋白质(诸如抗原)的ORF的GOI插入该表达系统中。表达系统通常使用调节GOI的转录和/或翻译的核酸序列，使得它们可以在其中有效地表达GOI。通常，表达系统使用具有增强的转录效率的启动子来增强转录效率，并且就提高GOI的翻译效率而言，使用真核生物特有的加帽系统。加帽系统通常在5'端具有7-甲基-鸟苷(m7G)的5'帽结构，以便有效翻译GOI。包含真核生物的翻译调节因子(例如eI4FA，eIF4E和eIF4G)的翻译起始复合物识别并结合5'帽位点以形成加帽结构并启动翻译以合成蛋白质。当在翻译起始位点形成加帽结构时，加帽结构启动蛋白质合成，同时防止核酸酶作用导致的mRNA降解。必须执行体外转录(IVT)过程以装配具有加帽结构的核酸分子。例如，可以通过用限制酶处理质粒DNA(pDNA)以线性化pDNA，使用RNA聚合酶翻译线性化的pDNA以制造mRNA，然后将m7G(5')-ppp-(5')G，(即规则帽类似物)在5’末端附接该mRNA以制备加帽mRNA来装配具有加帽结构的核酸分子。然而，这样的帽类似物通常以相反的方向结合到5'末端，并且m7G核苷酸不能充当帽。所装配的mRNA中约有三分之一没有在帽位甲基化，并且这种mRNA无法启动蛋白质合成。备选地，不使用帽类似物进行IVT处理，然后使用市售的牛痘病毒加帽酶进行加帽反应。此外，可以使用抗反向帽类似物(ARCA)诱导蛋白质合成，该抗反向帽类似物可防止帽的反向反应(ARCA-加帽的mRNA)。已知ARCA-加帽的mRNA可以合成的蛋白质是规则帽类似物-加帽的mRNA的两倍，并且半衰期更长。然而，体外进行人工加帽反应(例如ARCA反应)非常昂贵并且效率低。因此，有必要开发一种具有提高的效率并且可以用作基因疫苗、基因疗法等的表达系统。免疫系统是指一种检测并去除生物体内的病原体或癌细胞，从而保护生物免受各种疾病的侵害的生物结构或机制。免疫系统可分为先天免疫系统(固有免疫系统，自然免疫系统)和适应性免疫系统(获得性免疫系统)。先天性免疫系统是一种保卫宿主的机制，可避免非特异性感染，并在不记忆特定病原体的情况下立即对病原体做出反应。各种动植物都有先天免疫系统，而植物、真菌和昆虫则只有先天免疫系统。相反，适应性免疫系统对抗原或病原体具有特异性，并且有必要通过适应性免疫系统中的抗原呈递过程来识别非自身抗原。因此，可能通过适应性免疫系统，针对特定抗原或针对通过特定抗原感染的细胞诱导特异性免疫应答。由于适应性免疫系统的记忆细胞可以募集过去执行过的免疫应答，因此当相同的病原体渗入身体时，可能迅速去除该病原体。此外，免疫系统可分为体液免疫和细胞介导的免疫(CMI)。在体液免疫中，源自骨髓的B淋巴细胞识别抗原，分化以分泌由糖蛋白(即免疫球蛋白(Ig))组成的抗体，然后所述分泌的抗体去除感染的病原体。CMI是一种免疫应答，其中源自胸腺的T淋巴细胞识别抗原从而分泌淋巴因子或直接杀死受感染的细胞。接种整个病原体或其一部分以诱导针对病原体的免疫应答的疫苗抗原已用于预防或治疗各种疾病。在这种情况下，优选诱导由疫苗抗原引起的各种免疫应答。目前，亚单位疫苗主要用于替代早期开发的减毒活疫苗或灭活的杀灭疫苗，因为亚单位疫苗包含明显的结构和组分。然而，亚单位疫苗使用佐剂来增强免疫应答，因为与现有技术的疫苗相比，疫苗显示出较低的免疫原性。由于抗体是针对大多数病原细菌或病毒的主要防御因子，因此只有疫苗抗原诱导的抗体才能预防多种疾病。但是，由于细胞介导的免疫应答对感染疾病起着重要作用，尚未在预防或治疗中开发出针对所述感染疾病的疫苗。在这种情况下，可能在使用佐剂诱导细胞介导的免疫应答时有效地开发疫苗。目前，明矾、金属盐(如氢氧化铝，磷酸铝或氢氧化铝磷酸硫酸盐(aluminumhydroxidephosphatesulphate))和MF59(基于角鲨烯的水包油乳液型佐剂)已经主要用作佐剂用于人疫苗佐剂。这种常用的佐剂几乎不诱导细胞介导的免疫，而主要诱导体液免疫。因此，仅在抗体可以抵抗感染的情况下才可以使用此类佐剂，并且它们不适用于需要细胞介导的免疫应答的疫苗。作为典型的病原体，微生物在其细胞壁上具有与病原体相关的分子模式(PAMP)，例如脂多糖(LPS)，β-1,3-葡聚糖和肽聚糖。由宿主的免疫系统组成的特定蛋白质，例如模式识别受体(PRR)或模式识别蛋白质(PRP)，可以识别此类PAPM。每个PRR或PRP都可以识别病原体表面上的适当PAMP，以形成复合物，该复合物诱导一系列免疫应答，如吞噬作用，结节形成，包囊，蛋白酶级联激活和抗菌肽合成。Toll样受体(TLR)是代表性的PRR，TLR激动剂已作为疫苗佐剂而开发，因为它们对免疫细胞显示出强大的活性。例如，内毒素LPS对免疫细胞上的TLR4显示出强大免疫活性。与人类等高等生物中的基因组DNA不同，细菌DNA在CpG基序中没有甲基化的胞嘧啶。高级生物中的免疫细胞能够细菌DNA，在该细菌DNA中CpG基序的胞嘧啶未甲基化为非自身抗原。在这种情况下，特异性受体TLR9识别细菌DNA。TLR9激动剂可以增强各种免疫应答，并且已将TLR9激动剂(例如包括CpG基序的寡核苷酸)作为佐剂开发。然而，用作TLR激动剂的LPS和CpG基序具有很强的毒性，会在身体中引起诸如炎症反应等副作用。
技术实现思路
技术问题相应地，本公开涉及可以减少由于相关技术的局限性和缺点而导致的一个或更多个问题的核酸分子、表达载体以及药物或医学应用。本公开的目的是提供一种有效表达目的肽或蛋白质而不会引起复杂且昂贵的过程的表达系统。本公开的另一个目的是提供可以诱导或刺激细胞介导的免疫应答以及体液免疫应答的药物组合物，例如佐剂。问题的解决方案根据一个方面，本公开提供了核酸分子，其包含至少一个表达控制序列，该表达控制序列包含病毒内部核糖体进入位点(IRES)元件；和至少一个编码区，所述至少一个编码区与所述至少一个表达控制序列可操作地连接并编码肽或蛋白质。在一个实施方案中，所述核酸分子可以进一步包含位于所述至少一个表达控制序列上游的多个腺苷和多个胸苷中的至少一个。病毒的IRES元素可源自小核糖核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.核酸分子，其包含:/n至少一个表达控制序列，其包含具有病毒5'非翻译区(5'UTR)的病毒内部核糖体进入位点(IRES)元件；/n至少一个编码区，其与所述至少一个表达控制序列可操作地连接，并编码肽或蛋白质；和/n位于所述至少一个表达控制序列上游的多个腺苷和多个胸苷中的至少一个。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180427 KR 10-2018-00492721.核酸分子，其包含:
至少一个表达控制序列，其包含具有病毒5'非翻译区(5'UTR)的病毒内部核糖体进入位点(IRES)元件；
至少一个编码区，其与所述至少一个表达控制序列可操作地连接，并编码肽或蛋白质；和
位于所述至少一个表达控制序列上游的多个腺苷和多个胸苷中的至少一个。


2.权利要求1所述的核酸分子，其中所述病毒IRES元件源自小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，披膜病毒科(Togaviridae)，双顺反子病毒科(Dicistroviridae)，黄病毒科(Flaviridae)，逆转录病毒科(Retroviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)中的至少一种。


3.权利要求1所述的核酸分子，其中所述病毒IRES元件源自柯萨奇B病毒，蟋蟀麻痹病毒，日本脑炎病毒，脑心肌炎病毒和辛德比斯病毒中的至少一种。


4.权利要求1所述的核酸分子，其进一步包含位于所述5'UTR下游的病毒3'非翻译区(3'UTR)，并且其中所述至少一个编码区位于所述5'UTR和所述3'UTR之间。


5.权利要求1所述的核酸分子，其中所述至少一个编码区编码抗原、抗原的片段、抗原的变体、抗原的衍生物、用于治疗疾病的肽和用于治疗疾病的蛋白质中的至少一种。


6.权利要求1所述的核酸分子，其中所述至少一个表达控制序列包含具有第一IRES元件的第一表达控制序列和位于所述第一表达控制序列的下游并具有第二IRES元件的第二表达控制序列。


7.权利要求6所述的核酸分子，其中所述至少一个编码区包含位于所述第一表达控制序列和所述第二表达控制序列之间的第一编码区和位于所述第二表达控制序列下游的第二编码区。


8.权利要求6所述的核酸分子，其中所述第一表达控制序列包括源自柯萨奇B病毒或蟋蟀麻痹病毒的第一病毒IRES元件，并且所述第二表达控制序列包含源自脑心肌炎病毒的第二病毒IRES元件。


9.权利要求1所述的核酸分子，其进一步包含在所述至少一个表达控制序列的上游的转录控制序列，以及位于所述至少一个编码区下游的多聚腺苷酸化信号序列或多...

【专利技术属性】
技术研发人员：南在晥，朴孝静，高海里，金勋，墎慧源，
申请(专利权)人：加图立大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR