一种器官发生途径再生黄草乌的方法技术

本发明专利技术提供了一种器官发生途径再生黄草乌的方法，涉及植物组培技术领域；所述方法以黄草乌的带节茎段为外植体，通过初代培养获得无菌新芽，以新长出的叶片为对象，通过诱导愈伤组织的形成、分化，再到壮苗、生根，获得了再生植株。经本发明专利技术所述方法，愈伤组织诱导率为78％；对愈伤组织进行增殖和分化，增殖率可达到3倍以上，5次继代后，分化率接近70％；将产生的芽培养1个月后可形成高约2cm左右的芽；将其接种到生根培养基上1个月后，平均生根率可达为87.5％。本发明专利技术为今后黄草乌种质资源的挖掘奠定基础，对黄草乌种苗的工业化生产，建立敲除毒性基因的遗传转化体系技术支撑，具有重要的理论和实践意义。

【技术实现步骤摘要】
一种器官发生途径再生黄草乌的方法
本专利技术属于植物组培
，具体涉及一种器官发生途径再生黄草乌的方法。
技术介绍
黄草乌(Aconitumvilmorinianum)为毛茛科乌头属多年生草本植物，又称草乌，为我国特有，主要分布于云贵高原。黄草乌的块根是云南特色药材，长期以来一直被用于镇痛抗炎。当前，黄草乌野生主产区仍把引种、驯化黄草乌的野生资源作为发展草乌种植业的主要手段。盲目地收集引种、毁灭性采挖野生黄草乌，已造成其分布区不断萎缩，其野生种质资源受到严重破坏。此外，黄草乌的药用部位根状茎含有剧毒，每年因误食黄草乌而导致中毒的事件频频发生。乌头属植物的毒性高低与其植株在生长过程中积累的主要次生代谢产物“双酯型二萜生物碱”的含量多少有关，需经过特殊处理以获得低毒性的水解产物才可入药，而且该过程费时费力，增加了成本。通过生物技术手段建立黄草乌的组培快繁体系，满足种植行业对种苗的大量需求，可缓解黄草乌野生资源的生存压力；通过基因工程手段对其具毒性的次生代谢产物主要合成基因进行技术敲除，获得“无毒”或“低毒”的黄草乌植株，对确保食用草乌人群的人身安全、降低种植区域相关用药企业的成本投入和提高种质资源的利用效率都具有积极的意义。目前，构建适于敲除次生代谢产物主要合成基因的遗传转化体系，关键是建立经由愈伤组织路径的植株再生体系。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于一种器官发生途径再生黄草乌的方法，为今后黄草乌种质资源的挖掘奠定基础，对黄草乌种苗的工业化生产，建立敲除毒性基因的遗传转化体系技术支撑，具有重要的理论和实践意义。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种器官发生途径再生黄草乌的方法，包括以下步骤：(1)以消毒后的黄草乌带节茎段为外植体，接种于初代培养基中进行初代培养，得无菌叶片；所述初代培养基以4MS培养基为基本培养基，还包括：NAA0.1～0.2mg/L、6-BA1.0～2.0mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；(2)将所述无菌叶片置于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤诱导，得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D4mg/L、噻苯隆3mg/L、IBA1.5mg/L、6-BA2mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；(3)将所述愈伤组织接种至愈伤组织增殖和分化培养基中进行增殖分化，得绿色芽点；所述愈伤组织增殖和分化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：KT2.5mg/L、6-BA3mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；(4)将所述绿色芽点置于不定芽生长培养基进行不定芽的生长培养；所述不定芽生长培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括：NAA0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；(5)将长至高1.8～2.5cm的不定芽接种到生根培养基上进行生根培养，得黄草乌再生植株；所述生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8。优选的，步骤(1)所述消毒包括：将清洗干净的黄草乌带节茎段，在无菌环境中，先用体积百分含量为75％的酒精消毒1min，再置于质量百分含量为0.2％的HgCl2中浸泡10min，然后用无菌水冲洗5次。优选的，步骤(1)所述初代培养的温度为25±3℃，光照强度为20～40μmol/(m2·s)，光照时间为12h/d。优选的，步骤(2)将所述无菌叶片的四周修剪成长和宽分别为0.5cm和0.5cm的大小后，放入所述愈伤组织诱导培养基中进行愈伤诱导。优选的，所述愈伤诱导的温度为25±3℃，光照强度为10～20μmol/(m2·s)，光照时间为12h/d。优选的，步骤(3)中所述愈伤组织在所述愈伤组织增殖和分化培养基上每20～30d转接一次，而后再继续进行增殖分化。优选的，所述增殖分化的温度为25±3℃，光照强度为20～40μmol/(m2·s)，光照时间为12h/d。优选的，步骤(4)所述不定芽的生长培养的温度为25±3℃，光照强度为20～40μmol/(m2·s)，光照时间为12h/d。优选的，步骤(5)所述生根培养的温度为25±3℃，光照强度为20～40μmol/(m2·s)，光照时间为12h/d。优选的，所述生根培养的时间为1个月以上。本专利技术提供了一种器官发生途径再生黄草乌的方法，以黄草乌的带节茎段为外植体，通过初代培养获得无菌新芽，再以新长出的叶片为对象，通过诱导其愈伤组织的形成、分化，再到壮苗、生根(图1)，获得了经由器官发生路径形成的再生植株。在本专利技术中，经过愈伤诱导后，诱导得到的愈伤组织块疏松，淡黄色颗粒状，诱导率约为78％；将获得的淡黄色疏松颗粒状愈伤组织转移至愈伤组织增殖和分化培养基，1个月后愈伤组织块的边缘会分化出绿色的芽点，同时愈伤组织也在增殖，增殖率可达到3倍以上，连续继代培养4次后，绿色芽点的出现率可达36％(分化率)，随着继代次数的增加，分化率也会提高，到第5次继代后，分化率接近70％，且有少量的植株出现；将愈伤组织分化后得到的绿色芽点转接到不定芽生长培养基上，培养1个月后可形成高约2cm左右的芽；将长至高约2cm左右的芽接种到生根培养基上，15d左右开始生根，培养1个月后，平均生根率可达为87.5％。本专利技术为今后黄草乌种质资源的挖掘奠定基础，对黄草乌种苗的工业化生产，建立敲除毒性基因的遗传转化体系技术支撑，具有重要的理论和实践意义。附图说明图1为愈伤分化诱导及分化过程，其中A：叶片；B-D：愈伤组织；E-G:不定芽；H：丛芽；I：再生植株；图2为黄草乌再生植株。具体实施方式本专利技术提供了一种器官发生途径再生黄草乌的方法，包括以下步骤：(1)以消毒后的黄草乌带节茎段为外植体，接种于初代培养基中进行初代培养，得无菌叶片；所述初代培养基以4MS培养基为基本培养基，还包括：NAA0.1～0.2mg/L、6-BA1.0～2.0mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；(2)将所述无菌叶片置于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤诱导，得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D4mg/L、噻苯隆3mg/L、IBA1.5mg/L、6-BA2mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；(3)将所述愈伤组织接种至愈伤组织增殖和分化培养基中进行增殖分化，得绿色芽点；所述愈伤组织增殖和分化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：KT2.5mg/L、6-BA3mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；(4)将所述绿色芽点置于不定芽生长培养基进行不定芽的生长培养；所述不定芽生长培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括：NAA0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；...

【技术保护点】
1.一种器官发生途径再生黄草乌的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)以消毒后的黄草乌带节茎段为外植体，接种于初代培养基中进行初代培养，得无菌叶片；所述初代培养基以4MS培养基为基本培养基，还包括：NAA 0.1～0.2mg/L、6-BA 1.0～2.0mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；/n(2)将所述无菌叶片置于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤诱导，得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D 4mg/L、噻苯隆3mg/L、IBA1.5mg/L、6-BA 2mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；/n(3)将所述愈伤组织接种至愈伤组织增殖和分化培养基中进行增殖分化，得绿色芽点；所述愈伤组织增殖和分化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：KT 2.5mg/L、6-BA3mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；/n(4)将所述绿色芽点置于不定芽生长培养基进行不定芽的生长培养；所述不定芽生长培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括：NAA 0.2mg/L、6-BA 1.0mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；/n(5)将长至高1.8～2.5cm的不定芽接种到生根培养基上进行生根培养，得黄草乌再生植株；所述生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8。/n...

【技术特征摘要】
1.一种器官发生途径再生黄草乌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以消毒后的黄草乌带节茎段为外植体，接种于初代培养基中进行初代培养，得无菌叶片；所述初代培养基以4MS培养基为基本培养基，还包括：NAA0.1～0.2mg/L、6-BA1.0～2.0mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；
(2)将所述无菌叶片置于愈伤组织诱导培养基中进行愈伤诱导，得愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：2,4-D4mg/L、噻苯隆3mg/L、IBA1.5mg/L、6-BA2mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；
(3)将所述愈伤组织接种至愈伤组织增殖和分化培养基中进行增殖分化，得绿色芽点；所述愈伤组织增殖和分化培养基以MS培养基为基本培养基，还包括：KT2.5mg/L、6-BA3mg/L、蔗糖30g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；
(4)将所述绿色芽点置于不定芽生长培养基进行不定芽的生长培养；所述不定芽生长培养基以WPM培养基为基本培养基，还包括：NAA0.2mg/L、6-BA1.0mg/L、蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8；
(5)将长至高1.8～2.5cm的不定芽接种到生根培养基上进行生根培养，得黄草乌再生植株；所述生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，还包括：蔗糖20g/L和琼脂5.6g/L，pH值为5.8。


2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)所述消毒包括：将清洗干净的黄草乌带节茎段，在无菌环境中，先用体积百分含量为75...

【专利技术属性】
技术研发人员：何俊，浦秀丽，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53