一种百香果离体快繁及遗传转化方法技术

本发明专利技术提供一种百香果离体快繁及遗传转化方法，包括无菌外植体的大量快速获取、离体快繁方法，遗传转化方法。本发明专利技术采用无菌苗茎段为外植体，有效改良了百香果遗传转化中外植体大量褐化死亡的现象，其中离体快繁培养基低浓度植物生长调剂的使用不仅可以使植株更加健康高效的生长，也可以降低生产中的成本。

【技术实现步骤摘要】
一种百香果离体快繁及遗传转化方法
本专利技术涉及园艺植物繁殖与新品种培育领域，特别涉及一种百香果离体快繁及遗传转化方法。
技术介绍
百香果扩繁主要采用实生苗与蔓条扦插繁殖，组织培养在生产上运用较少。现有的百香果离体快繁无菌外植体获取方式主要依靠将种子进行无菌播种，或者直接取野外植株进行消毒获得。百香果组织培养主要采用MS培养基+3%蔗糖的通用培养基，在诱导愈伤组织，诱导丛生芽等步骤中分别加入不同比例的生物生长调节剂，如愈伤组织诱导培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.05mg/LTDZ,丛生芽诱导培养基：MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.05mg/LTDZ。实生苗繁殖中，种子萌发率与成活率低，缓苗期长、抗病性低；蔓条扦插繁殖若操作不当会加快品种退化、病害增加，致使产量降低。无菌外植体获得过程，因为百香果含有丰富的内生菌，在使用野外百香果材料进行离体消毒时无法有效的去除，即使使用高浓度消毒液长时间消毒也容易导致外植体快速死亡；同时因为百香果种子含有很厚的种壳，采用无菌条件下萌发，萌发率很低，即使采用物理破壳方式进行处理也非常容易造成胚轴受损无法萌发。现有的百香果离体快繁技术没有对培养基的最适蔗糖浓度进行筛选。部分方案使用了相对较高浓度的植物生长调节剂，实际操作后发现会出现节间缩短，伤口愈伤组织膨大且木质化等非正常生长的现象，且没有对最适宜的百香果壮苗培养基进行筛选。同时，现有遗传转化使用子叶或者胚轴作为侵染材料，获取成本较高且效率慢，特别是子叶侵染后容易因为农杆菌毒性而死亡。并且现有技术侵染结束后直接由共培养转入筛选培养，外植体易因为突然接触高浓度抗生素而导致褐化死亡。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种百香果离体快繁及遗传转化方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种百香果离体快繁及遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：（1）无菌外植体的大量快速获取：将种子从果实中剥离出来后清洗干净，浸种72h，然后一穴一粒种植于128孔穴盘中，基质为经过高压灭菌的纯蛭石；将穴盘置于28-32℃的环境中，种子15日之后萌发；待子叶刚刚展开时截取胚轴至茎尖部分并冲洗干净，置于饱和洗衣粉水中浸泡20min，然后使用流水冲洗30min，后续步骤在超净工作台中完成；将材料用75%w/v酒精浸泡30s，无菌双蒸水冲洗2次，然后使用7.5%w/v的次氯酸钠溶液浸泡10min，期间不断晃动瓶身，完成后使用无菌双蒸水冲洗3-6次，将外植体接种于生长培养基中生长；30天后芽苗长大，截取无菌苗节间茎段作为快繁外植体；（2）离体快繁方法：快繁外植体接种到愈伤组织诱导培养基中培养7天，然后转移至分化培养基中诱导丛生芽，将丛生芽切下转移至生根壮苗培养基中进行培养，获得组培苗；在移植前2天将生长健壮的组培苗瓶盖打开进行炼苗，移栽前使用自来水冲洗根部残留培养基，然后移栽到泥炭土与珍珠岩的质量比例为7∶3的混合基质中进行培养，获得无菌苗；（3）遗传转化方法：以步骤（2）中无菌苗的茎段为侵染材料，先将侵染材料在愈伤组织诱导培养基中进行预培养3天，侵染时将侵染材料浸泡在农杆菌侵染液中15min，期间不断晃动瓶身；然后转移至不含任何抗生素的愈伤组织诱导培养基中共培养3天，后转移到含有300mg/L羧苄青霉素的愈伤组织诱导培养基中延迟培养7天，然后将愈伤组织转移到含有50mg/L卡那霉素与300mg/L羧苄青霉素的分化培养基中分化丛生芽并进行筛选培养，获得阳性外植体，最后将阳性外植体转移至含有50mg/L卡那霉素与300mg/L羧苄青霉素的生根壮苗培养基进行培养。所述农杆菌侵染液制备方法：挑农杆菌单菌落至于装有1mlYEB液体培养基的1.5ml离心管中，置于28℃摇床中，200rpm培养8h，然后在无菌环境下将全部菌液转移至装有含200mg/LAS的50mlYEB液体培养基的100ml三角瓶中，置于28℃摇床中，200rpm培养至农杆菌od值=0.8，农杆菌培养过程中使用透气封口膜对三角瓶进行密封。将菌液置于灭菌过的离心管中5000rpm离心5min，倒掉上清液，使用含有3%蔗糖+200mg/LAS的1/2MS液体培养基重悬至od值=0.6，然后室温下静置3h。所述生长培养基为MSM+0.25mg/LTDZ+0.1mg/LIBA+2wt.%蔗糖；所述愈伤组织诱导培养基MSM+0.25mg/LTDZ+0.5mg/LIBA+2wt.%蔗糖；所述分化培养基为MSM+0.5mg/LTDZ+0.1mg/LIBA+2wt.%蔗糖；所述生根壮苗培养基为MSM+2wt.%蔗糖。本专利技术的优点在于：本专利技术采用对在消毒蛭石中萌发的百香果幼苗的进行消毒而获得无菌苗，解决了因为含有丰富的内生菌，无法直接取材于田间植株获得无菌外植体，以及利用无菌种子在密封组培瓶中播种低萌发率的问题，可以快速地获得大量无菌苗。本专利技术采用适宜的愈伤组织诱导、丛生芽诱导和植株生根壮苗的低浓度激素配比培养基，特别是培养基中的蔗糖含量对外植体生长具有显著影响。本专利技术采用无菌苗茎段为外植体，有效改良了百香果遗传转化中外植体大量褐化死亡的现象。离体快繁培养基低浓度植物生长调剂的使用不仅可以使植株更加健康高效的生长，也可以降低生产中的成本。附图说明图1培养基含糖量对组培苗生长的影响。图2高浓度IBA导致愈伤组织膨大木质化。具体实施方式实施例1一种百香果离体快繁及遗传转化方法，所述方法包括如下步骤：（1）无菌外植体的大量快速获取：将种子从果实中剥离出来后清洗干净，浸种72h，然后一穴一粒种植于128孔穴盘中，基质为经过高压灭菌的纯蛭石；将穴盘置于30℃的环境中，种子15日之后萌发；待子叶刚刚展开时截取胚轴至茎尖部分并冲洗干净，置于饱和洗衣粉水中浸泡20min，然后使用流水冲洗30min，后续步骤在超净工作台中完成；将材料用75%w/v酒精浸泡30s，无菌双蒸水冲洗2次，然后使用7.5%w/v的次氯酸钠溶液浸泡10min，期间不断晃动瓶身，完成后使用无菌双蒸水冲洗4次，将外植体接种于生长培养基中生长；30天后芽苗长大，截取无菌苗节间茎段作为快繁外植体；此无菌外植体存活率达到99%以上。而从野外获得的百香果外植体经过消毒获得无菌苗的存活率非常低，只有当次氯酸钠浓度达到10%才能少量避免内生菌污染，但是随着消毒时间的增加外植体容易发生褐化或者白化现象。只有消毒时间介于7.5-10分钟的时候无菌苗的存活率可以达到6.67%。（2）离体快繁方法：快繁外植体接种到愈伤组织诱导培养基中培养7天，然后转移至分化培养基中诱导丛生芽，增殖系数可达到22，将丛生芽切下转移至生根壮苗培养基中进行培养，获得组培苗；在移植前2天将生长健壮的组培苗瓶盖打开进行炼苗，移栽前使用自来水冲洗根部残留培养基，然后移栽到泥炭土与珍珠岩的质量比例为7∶3的混合基质中进行培养，获得无菌苗；（3）遗传转化方法：以步骤（2）中无菌苗的茎段为侵染材料，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种百香果离体快繁及遗传转化方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：/n（1）无菌外植体的大量快速获取：将种子从果实中剥离出来后清洗干净，浸种72h，然后一穴一粒种植于128孔穴盘中，基质为经过高压灭菌的纯蛭石；将穴盘置于28-32℃的环境中，种子15日之后萌发；待子叶刚刚展开时截取胚轴至茎尖部分并冲洗干净，置于饱和洗衣粉水中浸泡20min，然后使用流水冲洗30min，后续步骤在超净工作台中完成；将材料用75%w/v酒精浸泡30s，无菌双蒸水冲洗2次，然后使用7.5% w/v的次氯酸钠溶液浸泡10min，期间不断晃动瓶身，完成后使用无菌双蒸水冲洗3-6次，将外植体接种于生长培养基中生长；30天后芽苗长大，截取无菌苗节间茎段作为快繁外植体；/n（2）离体快繁方法：快繁外植体接种到愈伤组织诱导培养基中培养7天，然后转移至分化培养基中诱导丛生芽，将丛生芽切下转移至生根壮苗培养基中进行培养，获得组培苗；在移植前2天将生长健壮的组培苗瓶盖打开进行炼苗，移栽前使用自来水冲洗根部残留培养基，然后移栽到泥炭土与珍珠岩的质量比例为7∶3的混合基质中进行培养，获得无菌苗；/n（3）遗传转化方法：以步骤（2）中无菌苗的茎段为侵染材料，先将侵染材料在愈伤组织诱导培养基中进行预培养3天，侵染时将侵染材料浸泡在农杆菌侵染液中15min，期间不断晃动瓶身；然后转移至不含任何抗生素的愈伤组织诱导培养基中共培养3天，后转移到含有300mg/L羧苄青霉素的愈伤组织诱导培养基中延迟培养7天，然后将愈伤组织转移到含有50mg/L卡那霉素与300mg/L羧苄青霉素的分化培养基中分化丛生芽并进行筛选培养，获得阳性外植体，最后将阳性外植体转移至含有50mg/L卡那霉素与300mg/L羧苄青霉素的生根壮苗培养基进行培养。/n...

【技术特征摘要】
1.一种百香果离体快繁及遗传转化方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）无菌外植体的大量快速获取：将种子从果实中剥离出来后清洗干净，浸种72h，然后一穴一粒种植于128孔穴盘中，基质为经过高压灭菌的纯蛭石；将穴盘置于28-32℃的环境中，种子15日之后萌发；待子叶刚刚展开时截取胚轴至茎尖部分并冲洗干净，置于饱和洗衣粉水中浸泡20min，然后使用流水冲洗30min，后续步骤在超净工作台中完成；将材料用75%w/v酒精浸泡30s，无菌双蒸水冲洗2次，然后使用7.5%w/v的次氯酸钠溶液浸泡10min，期间不断晃动瓶身，完成后使用无菌双蒸水冲洗3-6次，将外植体接种于生长培养基中生长；30天后芽苗长大，截取无菌苗节间茎段作为快繁外植体；
（2）离体快繁方法：快繁外植体接种到愈伤组织诱导培养基中培养7天，然后转移至分化培养基中诱导丛生芽，将丛生芽切下转移至生根壮苗培养基中进行培养，获得组培苗；在移植前2天将生长健壮的组培苗瓶盖打开进行炼苗，移栽前使用自来水冲洗根部残留培养基，然后移栽到泥炭土与珍珠岩的质量比例为7∶3的混合基质中进...

【专利技术属性】
技术研发人员：何锐杰，曾黎辉，余伟军，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35