基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法技术方案

本发明专利技术提供一种基于CRISPR‑Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法，所述方法利用CRISPR‑Cas12b系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3任一所示。本发明专利技术检测方法操作简单，检测时间短，对提取好的样品DNA进行检测，仅需在1小时以内即可出检测结果；对于实际样本菌液进行检测，只需要1‑2小时便可出检测结果：特异性强，灵敏度高，适用范围广。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法。
技术介绍
空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)是一种重要的食源性人畜共患病原菌。空肠弯曲菌可以引起人的腹泻、发热等症状，是细菌行胃肠炎的常见致病菌之一。空肠弯曲菌广泛存在于家禽、家畜以及鸟类的肠道内，在很多动物中属于正常携带细菌，能够通过食物链传递给人类，引起人类疾病。世界卫生组织已经将空肠弯曲菌列为最常见的食源性病原菌之一。空肠弯曲菌作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品安全、畜牧兽医和出入境检验检疫中均是必需检测的项目，有重要社会、经济意义。目前检测空肠弯曲菌采用的方法主要是传统的分离培养法，但由于空肠弯曲菌的培养条件较为苛刻，使得传统的分离培养法存在操作复杂、灵敏度低、特异性不强等弊端。因此，亟需开发一种快速精准的检测空肠弯曲菌的方法来满足现有的不足。基于Cas12b蛋白开发的CRISPR-Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,Crispr-associatedproteins)检测系统，是一种新型检测方法。利用Cas12b蛋白在sgRNA的引导下，识别匹配的目标序列后就会启动无差别的序列切割活性，即sgRNA和目标序列有单碱基的差异就不能激发其切割荧光探针的活性。CRISPR-Cas12b检测系统与传统的聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)相比，对靶标的检测达到了单碱基的水平，可用于SNP位点分型，这就赋予了CRISPR-Cas12b更高的特异性。同时CRISPR-Cas12b检测系统不需要繁琐的操作步骤，只需将反应体系于48℃孵育30-35min，65℃灭活5min，将反应体系于485nm的蓝光下观察颜色是否变成绿色即可，整个检测过程可在1-2h左右完成。目前尚未有关于利用CRISPR-Cas12b检测系统检测空肠弯曲菌报道。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测试剂盒和方法，用于解决现有技术中缺乏有效的空肠弯曲菌检测的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术一方面提供了基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测方法，所述方法利用CRISPR-Cas12b系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQIDNO.1-3任一所示。进一步地，所述CRISPR-Cas12b系统利用Cas12b和sgRNA进行CRISPR检测，所述sgRNA以所述靶标位点为把靶序列进行设计。所述sgRNA的设计原则为：在选取sgRNA靶向序列时，靶向序列5’端应具有5’-TTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列间不形成稳定二级结构。进一步地，所述sgRNA包括核苷酸序列如SEQIDNO.4-6任一或几个所示的序列。进一步地，所述方法还包括利用报告基因通过荧光显色技术显示检测结果。进一步地，所述方法具体包括：(1)体外转录纯化sgRNA；(2)提取样品基因组DNA；(3)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有CRISPR-Cas12b反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述CRISPR-Cas12b反应体系中含有针对空肠弯曲菌的设计的sgRNA序列；(4)CRISPR-Cas12b反应：反应管置于PCR仪上，设置参数，进行PCR反应；(5)CRISPR-Cas12b反应结束后，分析结果。进一步地，步骤(4)中，CRISPR-Cas12b反应的条件设置为：(a)48℃30-35min；(b)65℃5min。本专利技术的另一方面提供了一种用于检测空肠弯曲菌的CRISPR-Cas12b的检测试剂盒，所述试剂盒包括：Cas12b蛋白、sgRNA以及报告基因，所述CRISPR-Cas12b检测空肠弯曲菌的靶标位点如SEQIDNO.1-3任一所示。进一步地，所述CRISPR-Cas12b检测试剂盒利用Cas12b和sgRNA进行CRISPR检测，所述sgRNA以所述靶标位点为把靶序列进行设计。进一步地，所述sgRNA包括核苷酸序列如SEQIDNO.4-6任一或几个所示的序列。进一步地，所述报告基因包含如SEQIDNO.7-9任一或几个所示核苷酸序列，每个所述报告基因的两端分别含有荧光基团和猝灭基团。本专利技术利用顺式切割和反式切割原理进行检测：Cas12b蛋白在sgRNA的引导下识别到5’端含TTN的靶标序列，会促使双链DNA解链，解链后的靶标序列中的靶标链会与sgRNA行成R-loop，从而释放Cas12b中的RuvC的活性位点。此时解链后的非靶标链会被RuvC的活性位点切割，这一切割会导致靶标DNA的解旋，从而致使靶标DNA的靶标链也会被RuvC位点切割。当靶标DNA的靶标链被切割，则表明已发生顺式切割。此时一旦有单链DNA的进入，空间里被留出来的RuvC的活性位点，会对任意单链DNA(探针)进行切割，这一切割称为反式切割。根据这一切割特性，设计了两端分别含荧光基团和猝灭基团的探针序列。反应时检测整个体系的荧光，如果体系变成绿色，则探针序列被切割，证明是空肠弯曲菌。如反应液无颜色变化，可证明无空肠弯曲菌。本专利技术所述检测试剂盒是采用CRISPR-Cas12b技术来进行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些CRISPR-Cas12b技术所需要的常规试剂，如：fluorescencequenchingprobe(FAM-N12-BHQ1)、RNase-freewater、样品基因组DNA提取试剂等常用的CRISPR-Cas12b技术反应试剂中的一种或多种。由于此类CRISPR-Cas12b检测常用试剂可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装入试剂盒，可根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装入试剂盒。本专利技术的检测试剂盒，可以是含有单独包装的sgRNA，也可以是含有配置好含sgRNA的CRISPR-Cas12b检测液。所述CRISPR-Cas12b检测液可自行配置，也可直接以市售的不含sgRNA的通用CRISPR-Cas12b检测液加入sgRNA获得。例如，所述试剂盒中还可以含有Cas12b蛋白、fluorescencequenchingprobe(FAM-N12-BHQ1)、10xNEBBuffer3/Buffer3.1、RecombinantRNaseInhibitor、RNase-freewater。加入本专利技术的sgRNA、待测样本DNA提取物或者样本菌液即可获得CRISPR-Cas12b反应体系。优选地，所述检测试剂盒中还可以含有阳性对照。所述阳性对照为含有空肠弯曲菌的DNA样本。优选地，所述试剂盒中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测方法，所述方法利用CRISPR-Cas12b系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas12b系统的空肠弯曲菌检测方法，所述方法利用CRISPR-Cas12b系统检测靶标位点，所述靶标位点的核苷酸序列如SEQIDNO.1-3任一所示。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CRISPR-Cas12b系统利用Cas12b和sgRNA进行CRISPR检测，所述sgRNA以所述靶标位点为靶标序列进行设计。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述sgRNA包括核苷酸序列如SEQIDNO.4-6任一或几个所示的序列。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括利用报告基因通过荧光显色技术显示检测结果。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法具体包括
(1)体外转录纯化sgRNA；
(2)提取样品基因组DNA；
(3)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有CRISPR-Cas12b反应体系的PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述CRISPR-Cas12b反应体系中含有针对空肠弯曲菌设计的sgRNA序列；
(4)CRISPR-Cas12b反应：反应管置于PCR仪上，设置参数，进行PCR反应；

【专利技术属性】
技术研发人员：焦新安，黄钰，张云增，顾丹，黄金林，郁金燕，薛寒，徐晓萌，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32