促内皮细胞产外泌体的方法、外泌体制剂和应用技术

本发明专利技术公开了促内皮细胞产外泌体的方法、外泌体制剂和应用，其中，促内皮细胞产外泌体的方法，包括如下操作步骤：步骤1：取人脐静脉内皮细胞株进行贴壁培养及传代；步骤2：向步骤1所培养的贴壁细胞的培养液中加入三七总皂甙，然后在培养箱中继续培养；步骤3：从步骤2所得培养液中分离纯化出外泌体。通过往人脐静脉内皮细胞的传代培养液中加入三七总皂甙来诱导人脐静脉内皮细胞分泌外泌体，其分泌量显著提高。

【技术实现步骤摘要】
促内皮细胞产外泌体的方法、外泌体制剂和应用
本专利技术属于生物医药领域，尤其涉及一种促内皮细胞产外泌体的方法、外泌体制剂和应用。
技术介绍
目前，生物治疗已经成为生物医药领域重要的研究、开发和应用内容，随着全球范围内生物细胞技术和产业快速发展，我国国家级主管部门及地方也陆续颁布多项扶持政策支持细胞治疗的发展。细胞外囊泡是蛋白质、mRNA、miRNA和脂质运输来完成细胞间通讯通路的重要媒介，根据它们的大小和发生分为三类，包括外泌体、微泡和凋亡小体。其中，外泌体是直径大约为40-100nm的包装囊泡，由多种细胞分泌，内含有特定的蛋白质、脂质、细胞因子或遗传物质。来源于不同的组织的外泌体不仅具有其特异性蛋白和核酸，而且还包含其行使功能的关键分子。外泌体是纳米级大小的膜封闭囊泡，含有生物活性分子，包括蛋白质，RNA和miRNA等。它们充当信使来调节邻近细胞和远端靶细胞的功能。临床前研究表明，在某些情况下，外源性给予的外泌体可以重新指导细胞活动，从而发挥其治疗潜力。由外泌体介导的递送具有以下几个优点：1、具有高度生物相容性，如果它们来自适当的细胞[例如间充质干细胞(MSCs)或未成熟的树突状细胞(DC)]，则同时具备免疫惰性；2、能够穿越人体厚实的组织屏障，如血脑屏障(BBB)等。正常情况下，外泌体可以直接用作潜在治疗剂。外泌体具有非常广阔的治疗前景和市场，但产量是制约其应用的重要问题，国际上也都在寻找有效的提高外泌体产量的技术方法。至今国内外，只有美国俄亥俄州立大学化学与生物工程学院的JamesLee课题组专利技术了一种细胞纳米化生物芯片，在数量级上提高外泌体生产和核酸包载效率，在靶向性和疗效上大大超越目前临床实验正在测试的外泌体包载的基因治疗药物，这些结果在2019年12月16日发表在《NatureBiomedicalEngineering》上(ZhaogangYang,etal.Large-scalegenerationoffunctionalmRNA-encapsulatingexosomesviacellularnanoporation)，但至今以生物药物诱导的方法提高细胞外泌体产量的技术尚少见报道。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种提高内皮细胞外泌体活性制剂产量的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种促内皮细胞产外泌体的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：步骤1：取人脐静脉内皮细胞株进行贴壁培养及传代；步骤2：向步骤1所培养的贴壁细胞的培养液中加入三七总皂甙，然后在培养箱中继续培养；步骤3：从步骤2所得培养液中分离纯化出外泌体。上述技术方案中所述步骤1中传代培养的内皮细胞为人脐静脉内皮细胞株。上述技术方案中所述步骤1中培养液为内皮细胞培养基。上述技术方案中所述步骤2中培养液中的三七总皂甙的浓度为0.4mg/mL，所述培养液在加入三七总皂甙后继续培养24h。上述技术方案中所述步骤3中外泌体的分离纯化的具体步骤如下：收集所述步骤2中完成培养后培养液的上清液，于4℃条件下以3000g离心10min，离心后取上清液，并往离心后的上清液中加入ECS试剂并混匀，混匀后在2-8℃条件下静置1-3h，其中，所述ECS试剂的添加量为离心后上清液的体积比为1:4，静置完成后将其在4℃条件下以10000g离心60min，离心后弃上清液，并加入PBS溶液均匀吹打离心所得沉淀物，所述PBS溶液的用量为ECS试剂用量的1/25,然后在4℃条件下以12000g离心2min，取上清液，将所得上清液转入EPF柱上室中，于4℃条件下以3000g离心10min，离心后收集EPF柱管底的液体，所收集的液体即为纯化后的外泌体。本专利技术的目的之二在于提供一种采用如上所述方法所制备的外泌体活性制剂。本专利技术的目的之三在于将如上所制得的外泌体活性制剂应用在制备改善微血管功能的药物。与现有技术相比，本专利技术技术方案的有益效果在于：通过向人脐静脉内皮细胞的培养液中加入三七总皂甙来促进人脐静脉内皮细胞大量分泌外泌体，从而使得外泌体的制备更加方便，产量更高，且该方法专属性好，特异性强，准确度高，因此，采用本专利技术提供的方法能够简便，高效地提供外泌体靶向治疗药物的生物学数量，这对于内皮细胞外泌体靶向治疗药物的研究开发，临床应用都具有重要的意义。附图说明图1为本专利技术实施例中所制得的标准曲线。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。一、溶液配制配制浓度为TNF-α的母液为10μg/mL；由于三七总皂甙溶解度较低，需要在37℃的温度下缓慢溶解制成40mg/mL三七总皂甙溶液(100mg三七总皂甙粉末加入2.5mL内皮细胞培养基)，三七总皂甙溶液需贮存于4℃，且最好短期内(2-4周)使用完毕，每次使用时均需注意有没有三七总皂甙析出。二、人脐静脉内皮细胞传代培养取人脐静脉内皮细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)利用内皮细胞培养基(ECM,产自Sciencell,SanDiego,CA)进行原代培养，将原代人脐静脉内皮细胞原代培养2-3d后，去上清液并加入PBS润洗至少两次，然后加入消化液(0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA混合消化液)进行消化，其中消化液的加入量以覆盖贴壁的原代细胞为佳，待消化完全后去除消化液，并补充加入内皮细胞培养基，同时吹打至人脐静脉内皮细胞在培养基中分布均匀，得到人脐静脉内皮细胞的传代培养液。三、分组实验取三个培养皿分别加入等量上述人脐静脉内皮细胞的传代培养液，三个培养皿分别对应为空白组、对照组和实验组，其中空白组不作任何处理，对照组加入TNF-α的溶液的稀释液，使得对照组中TNF-α的浓度为10ng/mL，而实验组加入三七总皂甙溶液的稀释液，使得实验组中三七总皂甙的浓度为0.4mg/mL，然后将三个培养皿继续培养24h。四、外泌体收集与纯化4.1样品预处理4.1.1取样：从空白组、对照组和实验组中分别取20mL细胞培养液的上清液作为样品(如果是冻存样品，从冰箱取出后于25℃水浴中进行解冻，将完全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上)；4.1.2离心去细胞碎片：将每份样品分别转移至离心管中，于4℃以3000g离心10min，去除样品中的细胞碎片，并将每个离心管中的上清液分别转移到圆底离心管中；4.2提取外泌体4.2.1上清液预处理：向每个圆底离心管中加入5mLExosomoeConcentrationSolution(ECS试剂)，然后盖紧离心管盖，并通过涡旋振荡器混匀1min，再于2-8℃环境下静置2h；4.2.2沉淀外泌体：将上述处理后的圆底离心管均于4℃以10000g离心60min，弃上清，保留沉淀物，其中沉淀物中富含外泌体颗粒(注：尽可能吸净上清液)；4.2.3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.促内皮细胞产外泌体的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：/n步骤1：取人脐静脉内皮细胞株进行贴壁培养及传代；/n步骤2：向步骤1所培养的贴壁细胞的培养液中加入三七总皂甙，然后在培养箱中继续培养；/n步骤3：从步骤2所得培养液中分离纯化出外泌体。/n

【技术特征摘要】
1.促内皮细胞产外泌体的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
步骤1：取人脐静脉内皮细胞株进行贴壁培养及传代；
步骤2：向步骤1所培养的贴壁细胞的培养液中加入三七总皂甙，然后在培养箱中继续培养；
步骤3：从步骤2所得培养液中分离纯化出外泌体。


2.根据权利要求1所述的促内皮细胞产外泌体的方法，其特征在于，所述步骤1中传代培养的内皮细胞为人脐静脉内皮细胞株。


3.根据权利要求1所述的促内皮细胞产外泌体的方法，其特征在于，所述步骤1中培养液为内皮细胞培养基。


4.根据权利要求1所述的促内皮细胞产外泌体的方法，其特征在于，所述步骤2中培养液中的三七总皂甙的浓度为0.4mg/mL，所述培养液在加入三七总皂甙后继续培养24h。


5.根据权利要求1所述的促内皮细胞产外泌体的方法，其特征在于，所述步骤3中外...

【专利技术属性】
技术研发人员：仉红刚，张秋菊，李炳蔚，修瑞娟，
申请(专利权)人：中国医学科学院微循环研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11