一种宫内膜采集方法及宫内膜干细胞收获方法技术

本发明专利技术提供了一种宫内膜采集方法，该宫内膜采集方法包括以下步骤：S1吸附：使用内置微载体的卫生棉条吸附经血，微载体包括可降解微载体基质材料交联成的凝胶球芯、包被于球芯的明胶层、偶联于明胶上的DEAE；S2分离：将吸附经血的卫生棉条放入生理盐水中，离心，将离心后的卫生棉条加入EDTA中消化，洗涤，再离心，收集洗涤液，离心，取沉淀，即得宫内膜干细胞；本发明专利技术提供的一种宫内膜采集方法能够解决现有技术中难以将采集到的经血中的宫内膜分离出来的问题，本发明专利技术提供的宫内膜采集方法能够显著提高经血中宫内膜的收获量，可收获大量的宫内膜干细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种宫内膜采集方法及宫内膜干细胞收获方法
本专利技术属于干细胞
，特别涉及一种宫内膜采集方法及宫内膜干细胞收获方法。
技术介绍
子宫内膜干细胞是一类存在于子宫内膜基底层的成体干细胞，具有一般成体干细胞的自我更新，无限增殖和多向分化潜能，参与子宫内膜上皮和间充质细胞的周期性再生，在子宫内膜的动态再生修复中有至关重要的作用。经血是血液和一些脱落的子宫内膜、子宫颈年夜等的混杂液体，2008年美国科学家Patel等发现从健康女性经血中可分离处子宫内膜干细胞，且由于经血来源丰富、收集过程无创、无伦理争论等优点，渴望从经血中分离更多的宫内膜，但是，现有的方法难以对经血中的宫内膜进行收集。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供了一种宫内膜采集方法，该宫内膜采集方法包括以下步骤：S1吸附：使用内置微载体的卫生棉条吸附经血，微载体包括可降解微载体基质材料交联成的凝胶球芯、包被于球芯的明胶层、偶联于明胶上的DEAE；S2分离：将吸附经血的卫生棉条放入生理盐水中，离心，将离心后的卫生棉条加入EDTA中消化，洗涤，再离心，收集洗涤液，离心，取沉淀，即得宫内膜干细胞。其中，DEAE为纤维素，众所周知，当经血直接附着于棉条上时，很难将宫内膜从棉条上分离下来，本专利技术研究发现，将微载体附着于卫生棉条上，当卫生棉条吸附经血后，经血中的水分将微载体溶胀，但体积不会发生很大改变，经血中的宫内膜干细胞与溶胀后的微载体结合，取出后将其离心去除血液等杂质，再将离心后的卫生棉条通过EDTA消化下来，洗涤后再离心，即可得到宫内膜干细胞，其采集效果与普通棉条相比显著提高。进一步地，步骤S2的分离具体包括以下步骤：将粘附有宫内膜的卫生棉条放置于离心管内加入生理盐水后离心15-25min，转速为1500-2500rpm，取出离心后的卫生棉条，加入新的离心管内，加入EDTA消化5-10min，EDTA浸没卫生棉条，消化后洗涤卫生棉条，收集洗涤液，以1500-2500rpm的速度离心4-6min，取沉淀，即得宫内膜细胞，将制得的宫内膜细胞进行培养。进一步地，卫生棉条的横截面为“U”型，卫生棉条的表面包附有网状结构，微载体附着于网状结构上。进一步地，网状结构的底端设有开口，宫内膜采集卫生棉条底部还设有若干条拉绳；其中一条拉绳从网状结构底端的开口通过，剩余拉绳从网状结构的网格内穿过。进一步地，微载体的制备方法为：(1)制球：将浓度为1％-2％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为0.5％-3％的氯化钙溶液中反应生成海藻酸钙胶珠，纳米化海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的体积比为1:3-1:5；(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤一次；(3)包被：将浓度为10％-20％的吸附溶液和浓度为0.3％-1％的戊二醛溶液等比例混合均匀制得混合液，将海藻酸钙微胶珠浸泡在混合液中反应，混合液与纳米化海藻酸钠溶液的体积比为1-3:1；(4)洗涤：待包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤三次；(5)中和：加入浓度为0.5％-2％的甘氨酸溶液反应，甘氨酸溶液的体积与步骤(3)的混合液体积相同；(6)洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤三次；(7)偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为1-3mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为0.5-2mol/L的DEAE-HCl溶液进行搅拌；海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:1-3:1-3；(8)洗涤：除去多余的NaOH溶液和DEAE-HCl溶液，依次用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+和Mg2+的PBS缓冲液洗涤，每次洗涤均以300rpm的转速搅拌8min后放出洗涤液，所用无菌纯化水、0.1M盐酸、0.1mM盐酸、无Ca2+、Mg2+PBS缓冲液与海藻酸钙微胶珠的体积比例均为1-3:1，制得湿润微载体；(9)冻干：将步骤(8)所得到的微载体冻干得到微载体；吸附溶液是将吸附因子用水溶解制得的。进一步地，吸附因子包括质量比为1-2:1-2:5-10的壳聚糖、纤连蛋白和明胶；优选地，吸附因子包括质量比为1:1:5的壳聚糖、纤连蛋白和明胶。进一步地，步骤(2)、步骤(4)和步骤(6)中至少一个的用无菌纯化水洗涤具体操作方法为：以50-300rpm的转速搅拌5-10min后弃洗涤液去除多余液体，纯化水与海藻酸钙微胶珠的体积比例为1-3:1。进一步地，步骤(3)将海藻酸钙微胶珠浸泡在混合液中反应的反应条件为：温度为20-60℃，搅拌速度为50-300rpm，时间为30min-2h；步骤(5)的反应条件如下：中和温度为40℃-60℃，搅拌速度为50-300rpm，中和时间为2-3h；步骤(7)两次搅拌的具体条件如下：搅拌速度为50-300rpm，搅拌温度为60-80℃，搅拌时间为0.5-2h；步骤(8)的洗涤方法如下：以50-300rpm的转速搅拌5-10min后弃洗涤液。本专利技术还提供了一种宫内膜干细胞收获方法，该方法是将权利要求1-9任一的宫内膜采集方法采集的宫内膜细胞使用集成自动离心机和培养箱的工作站连续自动培养，具体步骤如下：将粘附有宫内膜的卫生棉条或网状结构放置于离心管内加入生理盐水后离心15-25min，转速为1500-2500rpm，取出离心后的卫生棉条或网状结构，加入新的离心管内，加入EDTA消化5-10min，EDTA浸没卫生棉条或网状结构，消化后洗涤卫生棉条或网状结构，收集洗涤液，以1500-2500rpm的速度离心4-6min，取沉淀，即得宫内膜细胞，将制得的宫内膜细胞进行培养。本专利技术还提供了一种宫内膜干细胞培养方法，该方法是将粘附有宫内膜的卫生棉条或网状结构放入反应器内，在37℃、5％CO2条件下进行培养；24小时后进行第一次换液，此后每隔3天换液，待细胞生长至融合后进行传代。传代方法：吸去培养瓶内的旧培养基，加PBS冲洗3次，再加入消化液消化5min，消化液包括体积比为1:1的0.25％胰酶和0.04％EDTA；轻轻吹打细胞，使细胞脱离瓶底得到单细胞悬液；将单细胞悬液离心吹散，按1:8传代。本专利技术提供的一种宫内膜采集方法能够解决现有技术中难以将采集到的经血中的宫内膜分离出来的问题，本专利技术提供的宫内膜采集方法能够显著提高经血中宫内膜的收获量，可收获大量的宫内膜干细胞。附图说明图1.为实施例1的卫生棉条的结构示意图；图2.为实施例1的卫生棉条的结构示意图；图3.为实施例1的卫生棉条的结构示意图；图4.为实施例1的卫生棉条的结构示意图；其中，1为卫生棉条，2为微载体，3为网状结构，4为开口，5为拉绳。具体实施方式实施例1本实施例提供了一种宫内膜采集方法，该宫内膜采集方法包括以下步骤：S1吸附：使用内置微载体的卫生棉条吸附经血，所述微载体包括可降解微载体基质材料交联成的凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种宫内膜采集方法，其特征在于，所述宫内膜采集方法包括以下步骤：/nS1吸附：使用内置微载体的卫生棉条吸附经血，所述微载体包括可降解微载体基质材料交联成的凝胶球芯、包被于所述球芯的明胶层、偶联于所述明胶上的DEAE；/nS2分离：将吸附经血的卫生棉条放入生理盐水中，离心，将离心后的卫生棉条加入EDTA中消化，洗涤，再离心，收集洗涤液，离心，取沉淀，即得宫内膜干细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种宫内膜采集方法，其特征在于，所述宫内膜采集方法包括以下步骤：
S1吸附：使用内置微载体的卫生棉条吸附经血，所述微载体包括可降解微载体基质材料交联成的凝胶球芯、包被于所述球芯的明胶层、偶联于所述明胶上的DEAE；
S2分离：将吸附经血的卫生棉条放入生理盐水中，离心，将离心后的卫生棉条加入EDTA中消化，洗涤，再离心，收集洗涤液，离心，取沉淀，即得宫内膜干细胞。


2.如权利要求1所述的宫内膜采集方法，其特征在于，步骤S2所述分离具体包括以下步骤：将粘附有宫内膜的卫生棉条放置于离心管内加入生理盐水后离心15-25min，转速为1500-2500rpm，取出离心后的卫生棉条，加入新的离心管内，加入EDTA消化5-10min，EDTA浸没所述卫生棉条，消化后洗涤卫生棉条，收集洗涤液，以1500-2500rpm的速度离心4-6min，取沉淀，即得宫内膜细胞，将制得的宫内膜细胞进行培养。


3.如权利要求1所述的宫内膜采集方法，其特征在于，所述卫生棉条(1)的横截面为“U”型，所述卫生棉条的表面包附有网状结构(3)，所述微载体(2)附着于所述网状结构(3)上。


4.如权利要求3所述的宫内膜采集方法，其特征在于，所述网状结构(3)的底端设有开口(4)；所述卫生棉条(1)的底部设有若干条拉绳(5)，其中一条所述拉绳(5)从所述网状结构(3)底端的开口通过，剩余所述拉绳(5)从所述网状结构(3)的网格内穿过。


5.如权利要求1所述的宫内膜采集方法，其特征在于，所述微载体的制备方法为：
(1)制球：将浓度为1％-2％的纳米化海藻酸钠溶液滴入浓度为0.5％-3％的氯化钙溶液中反应生成海藻酸钙胶珠，所述纳米化海藻酸钠溶液与所述氯化钙溶液的体积比为1:3-1:5；
(2)洗涤：除去多余的氯化钙溶液，用无菌纯化水洗涤一次；
(3)包被：将浓度为10％-20％的吸附溶液和浓度为0.3％-1％的戊二醛溶液等比例混合均匀制得混合液，将所述海藻酸钙微胶珠浸泡在所述混合液中反应，所述混合液与纳米化海藻酸钠溶液的体积比为1-3:1；
(4)洗涤：待所述包被反应结束后，除去多余的混合液，用无菌纯化水洗涤三次；
(5)中和：加入浓度为0.5％-2％的甘氨酸溶液反应，所述甘氨酸溶液的体积与步骤(3)所述的混合液体积相同；
(6)洗涤：弃反应后的废液，用无菌纯化水洗涤三次；
(7)偶联DEAE-HCl：取洗涤后的海藻酸钙微胶珠，加入浓度为1-3mol/L的NaOH溶液搅拌，再加入浓度为0.5-2mol/L的DEAE-HCl溶液进行搅拌；所述海藻酸钙微胶珠的体积与NaOH溶液的体积和DEAE-HCl溶液的体积的比值为1:1-3:1-3；
(8)洗涤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝建秀，林俊堂，曹毓琳，滕睿頔，赵秀梅，白志惠，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11