一种细胞培养基制备方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养基技术领域，特别涉及一种细胞培养基制备方法，将基础培养基、ITS替代物、硫酸葡聚糖、还原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白、氨基酸调整混液和渗透压保护剂混合溶解，调整PH值，除菌处理后制得。与现有技术相比，本发明专利技术提供的一种细胞培养基制备方法，采用本发明专利技术制得的无血清细胞培养基对CHO细胞进行培养，代次多，增殖能力强，具有高蛋白表达量，通过微量金属取代胰岛素和转铁蛋白，不仅能促进细胞分裂增殖和维持细胞的传代培养，并且极大降低成本，而还原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白、氨基酸调整混液对细胞生长有显著的促进作用，通过添加渗透压保护剂，能有效提高细胞对高渗环境的耐受性，提高重组蛋白的产率，最大细胞密度达到9.8×10

【技术实现步骤摘要】
一种细胞培养基制备方法
本专利技术涉及细胞培养基
，特别涉及一种细胞培养基制备方法。
技术介绍
现代医药行业中，用重组技术制备生产蛋白质已经发展为标准化方式，通过克隆编码各蛋白的基因、用该待表达的基因转化适宜的表达宿主、最后产生和纯化所获得的重组蛋白质。其蛋白质包含单克隆抗体、细胞因子、融合蛋白等，此类蛋白质多用于治疗肿瘤、自身免疫疾病、炎性障碍、免疫抑制等多种医学领域。在工业化大规模生产蛋白质时，细胞培养的条件是影响产量的关键因素，因此，对于细胞培养的培养基配方，及培养条件的确定至关重要。血清补充动物细胞培养基通常能提高细胞活力以及重组蛋白质的产量，但含有血清的培养基所获得的基因重组蛋白质，会存在外源因子污染的风险。然而，在无血清培养基中生长的动物细胞对营养缺乏可能十分敏感，且营养缺乏可诱导细胞凋亡。因此，需要针对CHO细胞开发出无血清细胞培养基来维持细胞高密度批次培养和高蛋白表达量。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术提供一种细胞培养基制备方法，解决了使用血清补充动物细胞培养基时分化过程中出现误差、以及外源因子污染等问题，也解决了使用无血清培养基时无法为培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，导致细胞能达到的最高密度和蛋白表达量较低的问题。本专利技术采用的技术方案如下：一种细胞培养基制备方法，关键在于包括以下步骤：步骤一、将基础培养基、ITS替代物、硫酸葡聚糖、还原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白、氨基酸调整混液和渗透压保护剂混合溶解，制得混合物M1；>步骤二、将混合物M1调整PH到7.3-8.0范围内，并稀释定容，制得混合物M2；步骤三、将混合物M2进行过滤除菌处理，得到成品。优选的，所述基础培养基为DF12。优选的，所述ITS替代物为柠檬酸铁、硫酸锌和亚硒酸钠的混合物。优选的，所述氨基酸调整混液包括天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸。优选的，所述渗透压保护剂为谷氨酰胺。优选的，所述步骤二中所述混合物M2的渗透压为370-459mOsm/kg。优选的，所述步骤三中采用0.22μm或者是0.1μm孔径的过滤器除菌。优选的，成品中各组分的终浓度分别为：25-35mg/L硫酸葡聚糖、80-100mg/mL的DF12、15-20mg/L柠檬酸铁、10-18mg/L硫酸锌、15-25μg/L亚硒酸钠、20-30mg/L还原性谷胱甘肽、20-10mg/L腐胺、10-18mg/L白蛋白、8-20mg/L天冬氨酸、10-18mg/L丝氨酸、25-15mg/L精氨酸、8-18mg/L组氨酸、10-12mg/L半胱氨酸、15-25mg/L苯丙氨酸、15-25mg/L脯氨酸和25-35mg/L谷氨酰胺。有益效果：与现有技术相比，本专利技术提供的一种细胞培养基制备方法，采用本专利技术制得的无血清细胞培养基对CHO细胞进行培养，代次多，增殖能力强，状态好，具有高蛋白表达量，通过微量金属取代胰岛素和转铁蛋白，不仅能促进细胞分裂增殖和维持细胞的传代培养，并且极大降低成本，而还原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白、氨基酸调整混液对细胞生长有显著的促进作用，通过添加渗透压保护剂，能有效提高细胞对高渗环境的耐受性，进而提高重组蛋白的产率，最大细胞密度达到9.8×106cells/ml。附图说明图1为CHO-DG44细胞在本专利技术中的生长情况；图2为CHO-DG44细胞在本专利技术中的冻存和复苏效果；图3为CHO-DG44细胞在不同培养基中的细胞密度情况；图4为CHO-DG44细胞在不同培养基中的细胞活性情况；图5为CHO-DG44细胞在不同培养基中重组蛋白表达情况。具体实施方式为使本领域技术人员更好的理解本专利技术的技术方案，下面结合附表和具体实施方式对本专利技术作详细说明。实施例1细胞培养基制备方法步骤一、将DF12、硫酸葡聚糖、柠檬酸铁、硫酸锌、亚硒酸钠、还原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺混合溶解，制得混合物M1；步骤二、将混合物M1调整PH到7.3，并稀释定容，制得混合物M2，混合物M2的渗透压为370mOsm/kg；步骤三、采用0.22μm孔径的过滤器将混合物M2进行除菌过滤除菌处理，得到成品；成品中各组分的终浓度分别为：25mg/L硫酸葡聚糖、25mg/L谷氨酰胺、100mg/mL的DF12、20mg/L柠檬酸铁、10mg/L硫酸锌和25μg/L亚硒酸钠、30mg/L还原性谷胱甘肽、10mg/L腐胺、18mg/L白蛋白、8mg/L天冬氨酸、18mg/L丝氨酸、15mg/L精氨酸、8mg/L组氨酸、12mg/L半胱氨酸、15mg/L苯丙氨酸和15mg/L脯氨酸。实施例2细胞培养基制备方法步骤一、将DF12、硫酸葡聚糖、柠檬酸铁、硫酸锌、亚硒酸钠、还原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺混合溶解，制得混合物M1；步骤二、将混合物M1调整PH到8.0，并稀释定容，制得混合物M2，混合物M2的渗透压为420mOsm/kg；步骤三、采用0.1μm孔径的过滤器将混合物M2进行除菌过滤除菌处理，得到成品；成品中各组分的终浓度分别为：28mg/L硫酸葡聚糖、30mg/L谷氨酰胺、100mg/mL的DF12、20mg/L柠檬酸铁、15mg/L硫酸锌和20μg/L亚硒酸钠、20mg/L还原性谷胱甘肽、10mg/L腐胺、15mg/L白蛋白、10mg/L天冬氨酸、15mg/L丝氨酸、20mg/L精氨酸、10mg/L组氨酸、10mg/L半胱氨酸、15mg/L苯丙氨酸和20mg/L脯氨酸。实施例3细胞培养基制备方法步骤一、将DF12、硫酸葡聚糖、柠檬酸铁、硫酸锌、亚硒酸钠、还原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白、天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺混合溶解，制得混合物M1；步骤二、将混合物M1调整PH到7.6，并稀释定容，制得混合物M2，混合物M2的渗透压为459mOsm/kg；步骤三、采用0.22μm孔径的过滤器将混合物M2进行除菌过滤除菌处理，得到成品；成品中各组分的终浓度分别为：35mg/L硫酸葡聚糖、35mg/L谷氨酰胺、80mg/mL的DF12、15mg/L柠檬酸铁、18mg/L硫酸锌和15μg/L亚硒酸钠、20mg/L还原性谷胱甘肽、20mg/L腐胺、10mg/L白蛋白、20mg/L天冬氨酸、10mg/L丝氨酸、25mg/L精氨酸、18mg/L组氨酸、10mg/L半胱氨酸、25mg/L苯丙氨酸和25mg/L脯氨酸。对比例1与实施例2不同在于，基础培养基为DMEM。对比例2与实施例2不同在于，将ITS替代物替换为市购的ITS通用型培养混合剂。对比例3与实施例2不同在于，将氨基酸调整本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞培养基制备方法，其特征在于包括以下步骤：/n步骤一、将基础培养基、ITS替代物、硫酸葡聚糖、还原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白、氨基酸调整混液和渗透压保护剂混合溶解，制得混合物M1；/n步骤二、将混合物M1调整PH到7.3-8.0范围内，并稀释定容，制得混合物M2；/n步骤三、将混合物M2进行过滤除菌处理，得到成品。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养基制备方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、将基础培养基、ITS替代物、硫酸葡聚糖、还原性谷胱甘肽、腐胺、白蛋白、氨基酸调整混液和渗透压保护剂混合溶解，制得混合物M1；
步骤二、将混合物M1调整PH到7.3-8.0范围内，并稀释定容，制得混合物M2；
步骤三、将混合物M2进行过滤除菌处理，得到成品。


2.根据权利要求1所述的一种细胞培养基制备方法，其特征在于：所述基础培养基为DF12。


3.根据权利要求2所述的一种细胞培养基制备方法，其特征在于：所述ITS替代物为柠檬酸铁、硫酸锌和亚硒酸钠的混合物。


4.根据权利要求3所述的一种细胞培养基制备方法，其特征在于：所述氨基酸调整混液包括天冬氨酸、丝氨酸、精氨酸、组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸。


5.根据权利要求4所述的一种细胞培养基制备方法，其特征在于：所述渗透压保护剂为谷...

【专利技术属性】
技术研发人员：田晓萍，赵小云，
申请(专利权)人：河西学院，
类型：发明
国别省市：甘肃;62