甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种通过分别检测基质基因和非结构基因来检测可疑样品中的甲型流感病毒和乙型流感病毒的方法。信号能够被荧光检测系统检测到。

【技术实现步骤摘要】
甲型流感病毒和乙型流感病毒的检测方法
本专利技术涉及一种检测人体组织样品中的甲型流感病毒(FluA)和乙型流感病毒(FluB)的方法。具体来说，针对FluA，本专利技术提供用于检测甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1和H7N9中的至少一种的引物、探针和其它相关试剂。针对FluB，本专利技术提供用于检测乙型流感病毒的引物、探针和其它相关试剂。
技术介绍
流感在全世界的局部暴发或流行病中是常见的。流行病随时都有可能出现，但通常集中在高湿度的月份。它们突然发生，几乎没有预兆。受影响的人数可能从几百到几十万不等。流行病可能是短暂的，持续几天或几周，但是更大的流行病则可持续几个月。虽然流感在大多数个体中是一种轻度疾病，但它对老年人或虚弱的个体来说却会危及生命。流行病导致了生产力的巨大损失。世界卫生组织(WHO)委托建立了一个国际通信实验室网络，以监测传染性病毒中的抗原变化和感染的传播。根据世界卫生组织的调研和数据，甲型和乙型流感病毒占流感检测的大多数。人类甲型和乙型流感病毒几乎每年冬天都会在北美、东亚和东南亚造成季节性疾病流行。丙型流感感染通常会引起轻度呼吸道疾病，并且认为不会引起流行病。丁型流感病毒只会影响牛，并且未发现它会感染人或给人带来疾病。基于病毒表面上的以下两种蛋白质，将甲型流感病毒分成各种亚型：血凝素(H)和神经氨酸酶(N)。有18种不同的血凝素亚型和11种不同的神经氨酸酶亚型。甲型流感病毒可以进一步分解成不同的病毒株。甲型流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的正粘病毒属，这是一种具有螺旋对称性的ssRNA包膜病毒。甲型流感病毒的基因组是分段的，具有8个RNA片段。甲型流感病毒上存在四种抗原，即血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核衣壳(NP)和基质(M)蛋白。NA是一种类型特异性抗原，以A、B和C三种形式存在，为人类流感病毒的分类提供了基础。基质蛋白包围核衣壳并占颗粒质量的35-45％。HA介导病毒对细胞受体的附着。神经氨酸酶分子在包膜中以较少的数量存在。甲型流感病毒是人类季节性流感的主要成员，能够感染所有年龄的人并引起甚至可能导致死亡的严重疾病。季节性流感是由甲型流感病毒引起的一种重要的全球人类呼吸道疾病，一年四季普遍存在于热带地区，而温带地区主要发生在冬季，具有一定的季节性流行病特征。目前存在两种甲型流感病毒亚型在人类中传播，其可导致全球大流行性感染，即H1N1和H3N2。此外，H5N1和H7N9也被认为是重要的亚型，因为在人类中，H5N1和H7N9感染可能引起严重的疾病并且具有高死亡率。乙型流感病毒是病毒科正粘病毒科中的另一个属。乙型流感病毒基因组长14548个核苷酸并由8段线性负义单股RNA组成。分成多部分的基因组被衣壳化，每段处于单独的核衣壳中，并且核衣壳被一个包膜包围。乙型流感病毒不分亚型，但可以进一步分解为谱系和病毒株。目前，基于表面糖蛋白血凝素的抗原性质，乙型流感病毒存在两种共循环谱系。这些谱系被称为乙型/山形(Yamagata)/16/88样病毒和乙型/维多利亚(Victoria)/2/87样病毒。乙型流感病毒的衣壳被包膜包裹，而其病毒粒子则由包膜、基质蛋白、核蛋白复合物、核衣壳和聚合酶复合物组成。甲型和乙型流感病毒感染通过呼吸道飞沫传播。病毒颗粒与呼吸道上皮细胞结合，后者富含病毒受体。存在于病毒颗粒上的神经氨酸酶通过释放已经被上皮细胞表面上存在的粘液结合的病毒颗粒来帮助感染过程。流感的典型症状出现在感染后，并且包括明显的发烧、头痛、畏光、颤抖、干咳、不适、肌痛和喉咙干痒。发烧是连续的，持续3天左右。虽然乙型流感病毒的症状和治疗与甲型流感病毒的症状和治疗相似，但乙型流感病毒引发严重并发症的几率低于甲型流感病毒。甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1和H7N9都是高度传染性的并且能够引起严重的并发症。其中一种甲型流感亚型H5N1特别受到关注，因为它比其它甲型流感亚型和乙型流感病毒更快地发生突变，已被证实具有高致病性，会在男性中引起严重疾病。因此，为了实时监测突变，重要的是区分甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1和H7N9与乙型流感病毒。现如今存在可用于检测甲型和乙型流感病毒的RNA的RT-PCR分析，其提供最大的灵敏度和特异性。此外，可以对PCR产物进行测序以进行病毒株鉴定。最敏感和最受欢迎的样本是鼻咽拭子。然而，考虑到在获取鼻咽拭子时所涉及的困难，咽拭子和鼻拭子更为常用。鉴于上述情况，有必要开发一种具有高准确度和高稳定性的分析，用于同时检测可疑样品中的甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1和H7N9中的至少一种和乙型流感病毒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测方法，用于检测可疑样品中甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9的基质基因(下文称“M基因”)的存在，以及用于同时检测可疑样品中乙型流感病毒的非结构基因(下文称“NS基因”)的存在。更确切地说，如果可疑样品含有甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9中的至少一种，那么本专利技术将检测到这至少一种亚型。如果可疑样品含有乙型流感病毒的至少一种病毒株，那么本专利技术将检测到这至少一种病毒株。另外，如果可疑样品含有甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1中的至少一种和乙型流感病毒，那么本专利技术将分别检测到这些。具体来说，本专利技术的目的是提供指定的引物和探针，用于分别检测可疑样品中甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1和H7N9以及乙型流感病毒的存在。指定的探针和引物对甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1和H7N9以及乙型流感病毒具有特异性。此过程中也包括具有核酸外切酶水解能力的模板依赖性聚合酶。根据本专利技术，此目的通过一种检测可疑样品中甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1和H7N9中的至少一种和/或乙型流感病毒的存在的方法来达成，所述方法包含以下步骤：(a)提供怀疑含有甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9的M基因和/或乙型流感病毒的NS基因的样品；(b)提供对甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1和H7N9的M基因具有特异性的一对引物，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8；并且所述反向引物选自下组：SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18；(c)提供对乙型流感病毒的NB基因具有特异性的一对引物，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自下组：SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24和SEQIDNO:25；并且所述反向引物选自下组：SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测可疑样品中的甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9和乙型流感病毒的存在的方法，其包含以下步骤：/n(a)提供怀疑含有甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9的基质基因的样品，其中所述样品也被怀疑含有乙型流感病毒的非结构基因，/n(b)提供用于检测甲型流感病毒的所述基质基因的一对引物，其包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物选自以下群组：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，并且其中所述第二引物选自以下群组：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18，/n(c)提供用于检测乙型流感病毒的所述非结构基因的一对引物，其包含第三引物和第四引物，其中所述第三引物选自以下群组：SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，并且其中所述第四引物选自以下群组：SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，/n(d)提供ms2的一对引物作为内部对照，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自以下群组：SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41，并且所述反向引物选自以下群组：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46，/n(e)用逆转录酶和模板依赖性聚合酶扩增靶核酸，/n(f)在步骤(e)期间，将第一探针和第二探针与所述靶核酸退火以形成杂交产物，其中所述第一探针的序列对甲型流感病毒的所述基质基因具有特异性并且选自以下群组：SEQID NO:9和SEQ ID NO:10，并且所述第二探针对乙型流感病毒的所述非结构基因具有特异性并且选自以下群组：SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28，/n(g)在步骤(e)期间，使对所述ms2具有特异性的探针退火以形成杂交产物，其中所述探针的序列如SEQ ID NO:42所示，以及/n(h)检测由所述杂交产物产生的信号以作为所述靶核酸存在的指示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种检测可疑样品中的甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9和乙型流感病毒的存在的方法，其包含以下步骤：
(a)提供怀疑含有甲型流感亚型H1N1、H3N2、H5N1或H7N9的基质基因的样品，其中所述样品也被怀疑含有乙型流感病毒的非结构基因，
(b)提供用于检测甲型流感病毒的所述基质基因的一对引物，其包含第一引物和第二引物，其中所述第一引物选自以下群组：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8，并且其中所述第二引物选自以下群组：SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18，
(c)提供用于检测乙型流感病毒的所述非结构基因的一对引物，其包含第三引物和第四引物，其中所述第三引物选自以下群组：SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26，并且其中所述第四引物选自以下群组：SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35和SEQIDNO:36，
(d)提供ms2的一对引物作为内部对照，其包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物选自以下群组：SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40和SEQIDNO:41，并且所述反向引物选自以下群组：SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45和SEQIDNO:46，
(e)用逆转录酶和模板依赖性聚合酶扩增靶核酸，
(f)在步骤(e)期间，将第一探针和第二探针与所述靶核酸退火以形成杂交产物...

【专利技术属性】
技术研发人员：单亦智，苏家兴，
申请(专利权)人：克雷多生物医学私人有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG