用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用技术

本申请公开了一种用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用。本申请试剂包括引物对和探针，引物对上/下游引物分别为Seq ID No.1和2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或其反向互补序列；探针中，第30碱基修饰荧光基团6‑FAM‑Dt，第31碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1‑dT，3’末端修饰C3 Spacer。本申请试剂，能通过RT‑RPA对WNV进行敏感、特异、高效检测，耗时短、灵敏度高、硬件设备要求低，不需复杂的样本处理，特别适于现场快速检测；这对WNV快速防控，防止疫情传播，减少经济损失，保障畜牧业养殖生产安全具有重大意义。

【技术实现步骤摘要】
用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用
本申请涉及西尼罗河病毒检测领域，特别是涉及一种用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用。
技术介绍
西尼罗河病毒(WestNilevirus，WNV)是一种虫媒病毒，属于黄病毒科黄病毒属，是一种单链RNA病毒，可影响鸟类、人类和马。该疾病最大的危害就是造成人和马患上致命的脑炎，鸡、鸟等小型动物死亡等，会导致严重的公共卫生问题。因此，快速准确的诊断西尼罗河病毒对疫病的防控意义重大。野鸟是西尼罗河病毒的自然宿主，库蚊是主要传播媒介，病毒通过“鸟—蚊—鸟、人、其它动物”的生物传播链在自然界生存。1937年，该病毒在西尼罗河地区的乌干达被发现，因此而得名。2000年，在以色列中部和北部发现的439例神经侵袭性疾病，其中29人死亡。2017年，美国发生的2000多例西尼罗病毒感染病例，其中接近2/3的患者表现为严重的神经侵袭性疾病。该病对人类的健康和畜牧业的发展造成了极大的危害，世界卫生组织已将其列为当前全球的重大流行病之一。随着经济发展，频繁的国际旅行、候鸟的迁徙及进口动物及动物产品贸易，各国都存在WNV的传入风险。为防止西尼罗病毒的病毒株从国外传入我国，建立一种简便、快速、准确的诊断方法，有利于尽早切断病原传播，降低经济损失。目前，该病的病原检测方法包括病毒分离试验、RT-PCR、荧光定量PCR、巢式PCR、LAMP、二代测序技术等，抗体检测方法有ELISA、蚀斑减少中和试验(PRNT)。但这些检测技术方法操作复杂、对操作人员的技术要求高、检测时间长、难以适用于现场检测。因此亟需建立一种能够更好的适用于现场快速检测的WNV检测方法，以防止WNV传入或扩散，避免严重的公共卫生问题。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种新的用于西尼罗河病毒检测的试剂、试剂盒、检测方法及应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于西尼罗河病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-CCTGATTGAATTGGAACCACCCTTTGGAGACTCAT-3’SeqIDNo.2：5’-AGTCCCAAGCTGTATCTCCTAGGGCGGCTAATCTC-3’SeqIDNo.3：5’-CATAGTGGTGGGCAGAGGAGAACAACAGATTAATCACCATTGGCACAAGTC-3’SeqIDNo.3所示序列的探针中，第30个碱基修饰荧光基团6-FAM-Dt，第31个碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34个碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1-dT，3’末端修饰C3Spacer。需要说明的是，本申请的试剂中，引物对和探针都是针对西尼罗河E基因的保守片段设计的，特别用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的引物和探针。一步法逆转录重组酶聚合酶扩增，缩写RT-RPA，是在重组酶聚合酶扩增反应体系的基础上添加逆转录酶，使其可以直接对RNA模板进行一步法快速扩增。重组酶聚合酶扩增，缩写RPA，是英国TwistDx公司开发的一种新型的核酸等温扩增技术；该技术的关键之一是设计合适的扩增引物对和探针。但是，常规PCR引物对和探针并不适合RPA；常规PCR的引物相对太短、重组效率低；常规的探针系统，与RPA也不兼容。因此，无法通过常规的引物或探针设计软件直接输出适用于RPA的引物对和探针。目前设计RPA引物对和探针，主要根据TwistDx公司网站上提供的筛选指南，人工设计多条特异性引物和探针进行试验筛选，以获得扩增效率高、灵敏度高、特异性强的引物和探针。本申请的一种实现方式中，分别设计了2条RPA探针，并针对每条探针分别设计了6条上游引物和6条下游引物，用于试验筛选，最终筛选出SeqIDNo.1所示序列和SeqIDNo.2所示序列的引物组，以及SEQIDNo.3所示序列的探针，作为本申请的西尼罗河病毒检测试剂。还需要说明的是，RPA的原理是采用三个酶，在恒温下使一对引物对靶标进行指数扩增；本申请的试剂中，考虑到通过荧光检测的方式对RPA扩增产物进行检测，因此，在一对特异性引物的基础上提供了相应的特异性探针。可以理解，RPA扩增产物也可以采用其它方式，例如侧流层析试纸条、生物芯片、凝胶电泳等进行检测；因此，如果不采用荧光检测，则可以不使用SEQIDNo.3所示序列的探针。也就是说，本申请的试剂中，可以单独使用SeqIDNo.1和SeqIDNo.2所示序列的引物，也可以与探针一起使用，具体使用方式可以根据检测条件和环境选择。本申请的一种实现方式中，由于采用便携式的常温等温扩增荧光检测仪，优选的将引物和探针一起使用，通过荧光法对RPA扩增产物进行检测。本申请的一种实现方式中，探针的5’端标记有FAM荧光基团，探针的3’端标记有BHQ1淬灭基团。可以理解，FAM和BHQ1只是本申请的一种实现方式中具体采用的荧光基团和淬灭基团，不排除还可以采用其它荧光基团或淬灭基团，例如荧光基团还可以采用TET、JOE、HEX、CY3、CY5等，荧光淬灭基团则是根据荧光基团进行选择，荧光淬灭基团的吸收光谱只要能够覆盖荧光基团的发射光谱即可，例如BHQ2、BHQ3、Dabcy1、Tamra等。本申请的另一面公开了用于西尼罗河病毒检测的试剂在制备西尼罗河病毒检测试剂盒、检测试纸条或检测芯片中的应用。可以理解，本申请的试剂，实际上就针对西尼罗河病毒设计的特异性探针和引物对，当然可以制备成各种用于西尼罗河病毒检测的试剂盒、试纸条或检测芯片。本申请的再一面公开了一种用于西尼罗河病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于西尼罗河病毒检测的试剂。本申请的一种实现方式中，试剂盒中还含有冻干酶粉、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、去离子水。其中，冻干酶粉为用于RT-RPA的多种酶的混合冻干粉；再水化缓冲液为用于RT-RPA的浓缩反应液。使用时，先将冻干酶粉按使用需求配制成酶溶液，同时向再水化缓冲液中添加去离子水，配制成反应液，然后再添加醋酸镁溶液，以及本申请的引物和探针，最后添加待测样品，即可进行检测反应。需要说明的是，本申请的试剂盒，是特别针对西尼罗河病毒的重组酶聚合酶扩增检测设计的，因此，为了使用方便，试剂盒中完全可以进一步的包括用于一步法逆转录重组酶聚合酶扩增的反应液、酶和反应添加剂。其中，反应液在本申请的一种实现方式中为RehydrationBuffer，酶可以是混合有多种酶的RPA冻干酶粉，反应添加剂在本申请的一种实现方式中采用的是MgAc；另外，考虑到一步法逆转录的实现，本申请的一种实现方式中还包括了反转录酶MMLVReverseTranscriptase和RNA酶抑制剂RecombinantRNaseInhibitor。本申请的再一面公开了一种非诊断治疗目的的检测西尼罗河病毒的方法，包括采用本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于西尼罗河病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；/nSeq ID No.1：5’-CCTGATTGAATTGGAACCACCCTTTGGAGACTCAT-3’/nSeq ID No.2：5’-AGTCCCAAGCTGTATCTCCTAGGGCGGCTAATCTC-3’/nSeq ID No.3：5’-CATAGTGGTGGGCAGAGGAGAACAACAGATTAATCACCATTGGCACAAGTC-3’/nSeq ID No.3所示序列的探针中，第30个碱基修饰荧光基团6-FAM-Dt，第31个碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34个碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1-dT，3’末端修饰C3 Spacer。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于西尼罗河病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，所述引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，所述探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；
SeqIDNo.1：5’-CCTGATTGAATTGGAACCACCCTTTGGAGACTCAT-3’
SeqIDNo.2：5’-AGTCCCAAGCTGTATCTCCTAGGGCGGCTAATCTC-3’
SeqIDNo.3：5’-CATAGTGGTGGGCAGAGGAGAACAACAGATTAATCACCATTGGCACAAGTC-3’
SeqIDNo.3所示序列的探针中，第30个碱基修饰荧光基团6-FAM-Dt，第31个碱基替换为碱基类似物dSpacer，第34个碱基修饰荧光淬灭基团BHQ1-dT，3’末端修饰C3Spacer。


2.根据权利要求1所述的用于西尼罗河病毒检测的试剂，其特征在于：所述探...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴江，林彦星，黄超华，史卫军，花群义，阮周曦，贾鹏，曹琛福，曾少灵，林永涛，
申请(专利权)人：深圳海关动植物检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44