基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物制造技术

本发明专利技术涉及一种基于多重PCR的SARS‑CoV‑2全基因组核酸扩增特异性引物。本发明专利技术利用特异性引物对病毒核酸进行多重PCR扩增，使低峰度病毒核酸呈指数级扩增，结合二代测序平台，实现了病毒的全基因组测序快速分析，操作简单，成本低，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物
本专利技术属于新冠病毒全基因组核酸检测领域，特别涉及一种基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物。
技术介绍
2020年2月12日国际病毒分类委员会的冠状病毒研究小组(CSG)在生命科学论文预印本平台上发布了关于新型冠状病毒命名的最新论文，正式将新型冠状病毒从“2019-nCov”更名为“SARS-CoV-2"。目前，关于新型冠状病毒的研究正在热烈开展中。目前已有的SARS-CoV-2病毒核酸检测技术方案包括：qPCR技术；基于探针杂交捕获的核酸检测技术；宏基因组/宏转录组检测技术。但存在以下缺点：1)qPCR技术检测的病毒核酸区域不是全基因组；2)qPCR引物较少，病毒发生变异后可能导致无法检出；3)qPCR无法检测核酸突变；4)基于qPCR技术和探针杂交捕获的技术方法对起始模板量要求高，低峰度病毒可能无法检出；5)基于探针杂交捕获的技术方法实验周期较长，且试剂成本高；6)宏基因组/宏转录组的检测方法，费用高。多重PCR目前已广泛用于多种病原微生物的同时检测或鉴定某些病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定，其具备高效、系统、经济简便等优点。目前，关于采用多重PCR对SARS-CoV-2病毒全基因组进行核酸检测的研究还较少。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物，利用特异性引物对病毒核酸进行多重PCR扩增，使低峰度病毒核酸呈指数级扩增，结合二代测序平台，实现了病毒的全基因组测序快速分析。本专利技术提供了基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物，包括SEQIDNo.1-342所示序列的特异性引物。本专利技术还提供了基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测试剂盒，包括特异性引物。所述试剂盒还包括带有SARS-CoV-2反转录产物的无核酸水、酶混合物、特异性引物以及反应试剂。本专利技术还提供了基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测方法，包括如下步骤：(1)采用特异性引物对SARS-CoV-2反转录产物进行第一轮多重PCR反应，合并第一轮多重PCR反应产物后进行纯化；(2)将纯化后的第一轮多重PCR反应产物采用通用引物进行第二轮接头序列PCR反应或者将纯化后的第一轮多重PCR反应产物连接通用引物进行扩增，最后对产物进行纯化，经文库定量和质检后即可。所述步骤(1)和(2)中的纯化为磁珠纯化或过柱纯化。本专利技术还提供了一种基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测试剂盒的应用。本专利技术根据UCSC公布的SARS-CoV-2的核酸组序列，设计可扩增SARS-CoV-2基因组全长的特异性PCR扩增引物，共有171对特异性引物。引物可以和目标序列结合，通过PCR反应使病毒核酸呈指数级扩增，并且，在特异性引物的末尾增加了一段通用序列，用于第二轮PCR的引物结合。第二轮PCR使用通用引物，引物序列为文库接头的通用序列，可以和第一轮扩增子的末端序列结合，通过PCR反应使第一轮扩增产物再次进行指数级扩增。有益效果(1)本专利技术利用特异性引物对病毒核酸进行多重PCR扩增，使低峰度病毒核酸呈指数级扩增，结合二代测序平台，实现了病毒的全基因组测序快速分析；(2)本专利技术基于多重PCR的核酸检测技术，可以检测SARS-CoV-2的全基因组核酸序列，并给出病毒的突变位点信息，对起始模板量要求低，可以检测低峰度的SARS-CoV-2核酸序列；实验操作简单，快速，6小时即可完成文库构建工作；试剂成本远低于基于探针杂交捕获的技术方法和宏基因组的检测方法。附图说明图1为本专利技术的检测原理图。图2为实施例1中的文库质检图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例11.第1轮多重PCR反应①反应体系第1轮多重PCR反应分为2个反应管，使用的多重引物分别为引物混合物T1，引物混合物T2。2个反应管内的其他试剂相同。试剂体积(μl)无核酸水9-XPCR缓冲液(含底物)(反应试剂1)3.5PCR增强剂(反应试剂2)2.5引物混合物T1/T25SARS-CoV-2反转录产物X酶混合物10②反应条件(热盖105℃)2.第1轮PCR反应产物合并T1,T2反应管各吸取15μl产物合并，总体积为30μl。3.磁珠纯化合并产物1)向30μlPCR合并产物加入27μl室温平衡后的磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；2)室温孵育5min后，将PCR管置于磁力架上静置3min；3)彻底移除上清，将PCR管从磁力架取下，向管内加入50μl缓冲液，用移液器轻缓吸打混匀20次；4)室温孵育5min后，将PCR管置于磁力架上静置3min；5)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl80％乙醇溶液，静置30s；6)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清。7)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；8)将PCR管从磁力架取下，加入24μl无核酸水，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；9)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；用移液器吸取13.5μl上清液，转移到新的200μlPCR管内，管内上清液为合并后的多重PCR产物。4.第2轮接头序列PCR反应①反应体系试剂体积(μl)多重PCR产物13.5PCR缓冲液(含底物)(反应试剂1)2.5无核酸水2测序接头引物11测序接头引物21酶混合物10测序接头引物1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(I5-Index)ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT测序接头引物2：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(I7-Index)GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA根据I5-index,I7-i本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物，其特征在于：包括SEQ IDNo.1-342所示序列的特异性引物。/n

【技术特征摘要】
1.基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组核酸扩增特异性引物，其特征在于：包括SEQIDNo.1-342所示序列的特异性引物。


2.基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的特异性引物。


3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括带有SARS-CoV-2反转录产物的无核酸水、酶混合物、特异性引物以及反应试剂。


4.基于多重PCR的SARS-CoV-2全基因组检测方法，包括如下步骤：
(1)采用如权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋怀东，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海;31