一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术所提供的引物对基于鳗鲡疱疹病毒囊膜蛋白ORF49基因；使用本发明专利技术所提供的鳗鲡疱疹病毒定量检测试剂盒，可针对鳗鲡疱疹病毒可潜伏感染的特性，实现疑似鳗鲡疱疹病毒病病样的快速、准确定量检测，具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，提高无症状鳗鲡中鳗鲡疱疹病毒的检出率，对生产中鳗鲡“脱黏败血综合征”的防控具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒。
技术介绍
鳗鲡疱疹病毒（Anguillidherpesvirus,AngHV）是养殖鳗鲡的一种重要病毒性病原，由Sano等首次从日本养殖的日本鳗鲡（Anguillajaponica）体内分离。此后，从世界多地的不同品种鳗鲡体内分离出鳗鲡疱疹病毒，血清学和基因序列分析表明，亚洲和欧洲分离的鳗鲡疱疹病毒为同一病毒株。前期研究中，课题组用PCR法从福建省养殖的鳗鲡体内检测出鳗鲡疱疹病毒，并利用鳗鲡卵巢细胞系（Eelovarycellline,EO）从鳗鲡“脱黏败血综合征”病料中分离出鳗鲡疱疹病毒，这是我国大陆首次分离出该病毒。鳗鲡“脱黏败血综合征”是幼鳗养殖阶段的主要疫病，病鳗常呈现“脱黏”、“红头”、“败血”等症状，具有发病率高、传染性强、死亡量大等特点；若成鳗发病，则发病急、病症严重，多呈现“败血”症状，引起大量死亡，给养殖业者造成严重的经济损失。攻毒实验和流行病学分析表明，鳗鲡疱疹病毒就是鳗鲡“脱黏败血综合征”的致病病原。流行病学调查表明，鳗鲡疱疹病毒可潜伏感染，其致病性与环境、水温等密切相关，水温低时一般不发病，而水温升高时，发病率也升高。鳗鲡疱疹病毒属于疱疹病毒目(Herpesvirales)、鱼类疱疹病毒亚科（Alloherpesviridae）、鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus），其基因组为线性双链DNA，基因组全长248kb，含136个开放阅读框（ORF），由一段独特的长序列以及两侧11kb末端重复序列组成。基因序列分析表明，鳗鲡疱疹病毒与鱼类疱疹病毒亚科的其他病毒序列和基因序列的同源性均较低，仅有19％~58％。目前，已建立的鳗鲡疱疹病毒检测方法中原位杂交法操作复杂，且需要使用同位素标记，对操作人员的健康可能存在安全隐患；免疫过氧化物酶单层试验和免疫间接荧光抗体试验均需要鳗鲡疱疹病毒的抗体，不易获得；常用的PCR法无法对病毒进行准确定量，且扩增后必须进行琼脂糖电泳才可以观察扩增结果，操作步骤多，需时久。随着分子生物学技术的发展，qPCR法因其快速、灵敏、准确等特点被广泛用于病原检测。本专利技术拟针对鳗鲡疱疹病毒可潜伏感染的特性，提供一种利用SYBRGreenqPCR法定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物和试剂盒，区别于TaqMan探针法，具有特异性强、灵敏度高、成本低、操作简单等优点，为快速、准确的定量检测鳗鲡疱疹病毒提供了新的检测手段，提高无症状鳗鲡中鳗鲡疱疹病毒的阳性检出率，有利于鳗鲡“脱黏败血综合征”的提前预防。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒，试剂盒可用于鳗鲡组织和细胞样品中鳗鲡疱疹病毒的快速、定量检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点。本专利技术解决其技术问题所采用的方案是：提供一种用于定量检测鳗鲡疱疹病毒的特异性引物对，所述引物对是通过从设计的10对引物中优选获得，针对的靶标基因为鳗鲡疱疹病毒ORF49，所述引物序列为：AngHV_qF:5´-CCGTGGTGGTGCCTCTTATCTACA-3´AngHV_qR:5´-TCCTCCGCGGCGTCCACAG-3´本专利技术还提供一种用于定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，包含上述引物对、含有鳗鲡疱疹病毒ORF49基因的阳性质粒标准品、阴性对照品，SYBRPremixExTaqTMⅡ(TliRNaseHPlus)(2×)和ROXReferenceDyeⅡ(50×)（购自TaKaRa公司）。上述试剂盒中阳性质粒标准品浓度为1×109拷贝/μL，阴性对照品为灭菌ddH2O。上述试剂盒所采用的定量检测鳗鲡疱疹病毒方法为qPCR法，包括以下步骤：（1）建立qPCR反应标准曲线：阳性质粒标准品按10倍比稀释为108~101拷贝/μL8个浓度梯度，作为模板，以鳗鲡疱疹病毒qPCR检测的特异性引物对进行qPCR扩增，以模板拷贝数的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，制作标准曲线；（2）将样品DNA稀释至标准曲线范围内，以鳗鲡疱疹病毒qPCR检测的特异性引物对为引物，进行qPCR反应，得到样品Ct值，根据标准曲线计算样品中病毒拷贝数；（3）结果判定：Ct值＜35，且出现典型扩增曲线，则判断为阳性；阴性对照无典型扩增曲线，若阴性对照有扩增，则此次实验结果无效。所述qPCR的反应体系和条件为：反应体系：2×Mix10μL，上下游引物(10μM/μL)各0.8μL，DyeII0.4μL,DNA模板1μL，ddH2O7μL。扩增条件：95℃预变性30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。上述qPCR检测方法所使用的荧光染料为SYBRGreen。对建立的qPCR方法进行灵敏性、特异性和重复性检测，并分别用PCR和qPCR两种方法对前期收集的疑似患“脱黏败血综合征”的鳗鲡组织样本进行检测，比较两种检测方法的阳性检出率。上述的一种鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法，建立的标准曲线中质粒拷贝数与Ct值的线性关系为y=-3.2859x+37.427，相关系数R2为0.999，扩增效率为100.855%。上述的一种鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法，所述鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法对鳗鲡疱疹病毒的最低检出拷贝数为10个。上述的一种鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法，所述鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法的Ct值组内和组间变异系数均小于2%。将上述试剂盒应用于鳗鲡组织和细胞样品中鳗鲡疱疹病毒的快速、定量检测。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术提供的引物对是通过优选获得，针对的靶标基因为鳗鲡疱疹病毒ORF49。（2）基于该引物对提供了一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，该试剂盒灵敏性高，是普通PCR的100倍；特异性强，对几种常见的鳗鲡DNA病毒和阴性对照无扩增；重复性好，组内Ct值变异系数（C.V.）在0.05%~0.42%之间，组间Ct值C.V.在1.07%~1.13%之间，均小于2%。（3）本专利技术提供的定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒可应用于检测疑似鳗鲡疱疹病毒感染样品，对疑似样品的阳性检出率明显高于普通PCR，为快速、准确的定量检测样品中鳗鲡疱疹病毒的数量提供了新的检测方法，可应用于鳗鲡疱疹病毒病的诊断和流行病学研究。（4）本专利技术提供的定量检测鳗鲡疱疹病毒qPCR检测试剂盒使用的是SYBRGreen染料法，区别于TaqMan探针法，具有成本低、应用广泛等特点。附图说明图1为鳗鲡疱疹病毒ORF49基因的扩增片段电泳图；其中：泳道M为DL1000DNAmarker；泳道1为鳗鲡疱疹病毒，目的片段大小为693bp，泳道2为阴性对照。图2为本专利技术qPCR检测方法的标准曲线。图3为本专利技术qPCR检测的熔解曲线，108~101拷贝质粒的熔解曲线均只有一个熔解峰，Tm值为88.34~88.95℃。图4为本专利技术qPCR的灵敏性检测结果，其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的特异性引物对，其特征在于，所述引物序列为：/nAngHV qF: 5´-CCGTGGTGGTGCCTCTTATCTACA-3´；/nAngHV qR: 5´-TCCTCCGCGGCGTCCACAG-3´。/n

【技术特征摘要】
1.一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的特异性引物对，其特征在于，所述引物序列为：
AngHVqF:5´-CCGTGGTGGTGCCTCTTATCTACA-3´；
AngHVqR:5´-TCCTCCGCGGCGTCCACAG-3´。


2.一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对、含有鳗鲡疱疹病毒ORF49基因序列的阳性质粒标准品和阴性对照品，所使用的荧光染料为SYBRGreen。


3.根据权利要求2所述的定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒标准品浓度为1×109拷贝/μL，阴性对照品为灭菌ddH2O。


4.根据权利要求2所述的定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒是采用qPCR法进行检测，包括以下步骤：
（1）建立qPCR反应标准曲线：阳性质粒标准品按10倍比稀释为108~...

【专利技术属性】
技术研发人员：李英英，葛均青，
申请(专利权)人：福建省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35