葡萄的qRT-PCR内参基因及其引物与应用制造技术

本发明专利技术公开了葡萄的qRT‑PCR内参基因及其引物与应用，本发明专利技术首次鉴定了一个新的葡萄内参基因RRM1，并设计了针对该基因的qRT‑PCR引物。本发明专利技术根据前期的转录组数据通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个分析软件对Actin、18s‑rRNA、GAPDH、VvEF1‑γ、VvEF1‑α、EF1‑α、Ubiquitin、七个候选内参基因和RRM1，PPR2和MRE11三个新发掘的候选内参基因在七个不同的葡萄品种的果实、叶、卷须以及九个不同发育阶段的‘巨峰’果实样品中的稳定性进行了分析。结果表明，针对上述葡萄样品最佳内参基因数目为两个，不同的样品最优内参基因的选择不同，葡萄叶组织中的最佳内参基因为RRM1和EF1‑α，当包含所有样品时最佳内参基因组合为RRM1和Ubiquitin。本发明专利技术可为相关研究者在葡萄中开展qRT‑PCR工作时提供重要的参考。

【技术实现步骤摘要】
葡萄的qRT-PCR内参基因及其引物与应用
本专利技术涉及葡萄的qRT-PCR内参基因及其引物与应用，属于分子生物学

技术介绍
葡萄是世界范围内广泛种植的最重要的果树之一。葡萄的果实既可以鲜食，也可以用于制作葡萄酒和葡萄干，因此具有很高的营养价值和经济价值。目前，相关研究者已经发现和培育了大量葡萄新品种，并利用这些种质资源开展了大量科研工作。关于葡萄重要农艺性状分子机理及相关功能基因的研究极大地促进了葡萄产业的发展。在开展葡萄基础研究的过程中，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术发挥了重要作用，其具有反应时间短，重复性好和灵敏度高等诸多优点。但是，qRT-PCR结果也会受到多种因素的影响，例如：RNA质量，样品差异，设备误差，重复性，操作误差等。因此，在进行qRT-PCR时必须用内参基因来标准化和校准实验结果，内参基因的好坏直接影响qRT-PCR结果。一个好的内参基因必须能够持续稳定表达，并且不受样品和其他环境因素的影响。目前，已经被鉴定并广泛应用于植物中的内参基因主要是管家基因(house-keepinggenes)，例如：Actin，Ubiquitin，18s-rRNA(18sribosomalRNA)，GAPDH(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase)，EF1-α/γ(elongationfactor1-α/γ)等。然而，最近的研究表明，这些广泛应用的内参基因在某些特定的条件下表达并不稳定。因此，在开展一些特定的实验时，有必要选择特定的内参基因；在检测不同样品时，内参基因的选择也不尽相同。在一些果树品种(如：桃、苹果、草莓、火龙果等)中已经开始了一些相关的工作，结果均证明在检测不同的样品(如：不同的品种、组织或发育阶段)时，最优内参基因的选择也是有差异的。但是在葡萄中，关于内参基因的研究还较为匮乏，且葡萄的品种繁多，近年来也有大量的新品种被选育出来，这些都导致葡萄中内参基因的选择存在一定的盲目性，目前还没有绝对理想的内参基因可供选择。因此，在葡萄中评价常用的内参基因的稳定性，发掘和筛选更理想的内参基因尤为重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种葡萄qRT-PCR内参基因，所述内参基因为RRM1基因，在葡萄不同样品中具有较好的稳定性，可作为一个新的内参基因应用于葡萄基础研究中。其次，本专利技术的目的是提供上述RRM1基因为内参基因在qRT-PCR检测葡萄基因转录表达水平中的应用。同时，本专利技术的目的是提供用于特异性扩增RRM1基因的引物。最后，本专利技术的目的是提供在葡萄不同组织中进行qRT-PCR时的最佳内参基因组合。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种葡萄qRT-PCR内参基因，所述内参基因为RRM1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术提供了RRM1基因作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄基因转录表达水平中的应用。优选的，qRT-PCR检测采用核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的反向引物对RRM1基因进行特异性扩增。本专利技术提供了于特异性扩增RRM1基因的引物，正向引物的苷酸序列如SEQIDNO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。本专利技术鉴定了在葡萄不同组织中进行qRT-PCR时的最佳内参基因组合。本专利技术提供了RRM1基因和Ubiquitin基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄基因转录表达水平中的应用；优选的，采用核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的反向引物对RRM1基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQIDNO.22所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.23所示的反向引物对Ubiquitin基因进行特异性扩增。本专利技术提供了RRM1基因和EF1-α基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄叶组织基因转录表达水平中的应用；优选的，采用核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的反向引物对RRM1基因进行特异性扩增；采用核苷酸序列如SEQIDNO.20所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.21所示的反向引物对EF1-α基因进行特异性扩增。本专利技术的有益效果在于：本专利技术根据前期的转录组数据，并通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个分析软件对Actin、18s-rRNA、GAPDH、VvEF1-γ、VvEF1-α、EF1-α、Ubiquitin七个候选内参基因以及RRM1(SEQIDNO.1)，PPR2(SEQIDNO.2)和MRE11(SEQIDNO.3)三个新发掘的候选内参基因在七个不同的葡萄品种的果实、叶、卷须以及九个不同发育阶段的‘巨峰’果实样品中的稳定性进行了分析。结果表明本实验中所用样品最佳内参基因数目为两个，不同的样品最优内参基因的选择也是不同的，果实中的最佳内参基因组合为VvEF1-γ和18s-rRNA，叶为RRM1和EF1-α，卷须为EF1-α和Actin，果实发育阶段为EF1-α和VvEF1-α，当包含葡萄所有组织样品时最佳内参基因组合为RRM1和Ubiquitin。本研究可为相关研究者在葡萄中开展qRT-PCR工作时提供重要的参考。同时本研究发掘了一个新的葡萄内参基因RRM1，该基因可在未来广泛应用于葡萄中。附图说明图1是葡萄不同转录组数据中五个候选内参基因的表达情况热图；图中，F1-F4表示‘峰早’果实不同发育阶段；K1-K5表示‘巨峰’果实不同发育阶段；C1-C5表示不同处理时间的对照样品；H1-H4表示H2O2处理不同时间的样品；R1-R5表示核黄素处理不同时间的样品；A1-A5表示5-azaC处理不同时间的样品。图2是十个候选内参基因在所有样品中的Ct值盒形图；图中，部横线代表中位数，上下竖线表示最大值和最小值，黑色圆点表示异常值。图3是五个样品组合Pairwisevariation(V)分析结果；图中，V值可表示样品的最佳内参基因数目，若Vn/n+1<0.15，则最佳内参基因数目为n个。图4.是十个候选内参基因geNorm分析结果；图中，A-E：各内参基因在果实(A)、叶(B)、卷须(C)、不同发育阶段(D)和总样品(E)中的平均表达稳定性(M)，M值越小表示稳定性越高。图5是十个候选内参基因NormFinder分析结果；Stabilityvalue值越低，表示该基因稳定性越高。图6是十个候选内参基因BestKeeper分析结果；图中表示内参基因在不同样品中的标准偏差(standarddeviation，SD)，SD值越小表示稳定性越高。图7是用不同的内参基因检测基因VIT_16s0098g00410在‘巨峰’葡萄三个发育阶段果实中的表达量；图中，K1，K2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种葡萄qRT-PCR内参基因，其特征在于，所述内参基因为RRM1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种葡萄qRT-PCR内参基因，其特征在于，所述内参基因为RRM1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.RRM1基因作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄基因转录表达水平中的应用，其特征在于，RRM1基因核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的反向引物对RRM1基因进行特异性扩增。


4.用于特异性扩增RRM1基因的引物，其特征在于，正向引物的苷酸序列如SEQIDNO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。


5.RRM1基因和Ubiquitin基因共同作为内参基因在qRT-PCR检测葡萄基因转录表达水平中的应用。
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【专利技术属性】
技术研发人员：郭大龙，韦同路，余义和，裴茂松，刘海楠，郑玉萍，陈苏丹，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：河南;41