基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒及方法技术

一种基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒及方法，是用MNPs为载体及前体物，偶联目标物AFB1核酸适配体与Cy5标记的cDNA杂交形成的双链DNA，得到荧光淬灭的基底检测探针，然后在96聚苯乙烯微孔板上，以MNPs为前体物在盐酸消解下与K

【技术实现步骤摘要】
基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒及方法
本专利技术属于新型功能材料与生物传感检测
，具体涉及一种基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
黄曲霉毒素B1（AflatoxinB1，简写为AFB1）是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素），主要存在于土壤、动植物和坚果中，其中，最容易被AFB1污染的食品有花生、玉米、核桃和水稻。AFB1是已知的化学物质中致癌性最强的一种，它对人和动物均具有强烈的毒性，其毒性作用主要是对肝脏有严重的损害，因此它是引起食品安全事故的重要因素。由于极低的AFB1就能引发较为显著的生理毒性，因此对其检测需要高灵敏度、高选择性和高准确性的方法。目前，检测AFB1的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱/质谱联用法、免疫层析法和传统的酶联免疫分析法。高效液相色谱法和液相色谱/质谱联用法虽然有较高的检测准确度，但其仪器成本高，需要专业的操作人员，不适用于现场快速分析检测；免疫层析法虽有简单、快速和成本低的优点，但是其灵敏度和精密度较差；传统的酶联免疫分析法具有操作过程繁琐、成本高、检测周期长、易出现假阳性等缺点。因此，通过改良的酶联免疫方法实现对污染食品中AFB1含量简单、灵敏和准确的测定变得越来越重要。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于，克服现有技术的缺陷，提供一种基于PBNPs（普鲁士蓝纳米颗粒（Prussianbluenanoparticles），简写为PBNPs）原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒，实现AFB1便携可视的现场即时半定量及荧光准确定量检测。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒，该试剂盒包括AFB1单克隆抗体（Ab1）、生物素标记的AFB1核酸适配体（bio-aptamer）、Cy5标记的cDNA和链霉亲和素化的MNPs（SA-MNPs）；该链霉亲和素化的MNPs偶联生物素标记的AFB1核酸适配体与Cy5标记的cDNA杂交形成的双链DNA后得到检测探针。上述试剂盒还包括96孔聚苯乙烯微孔板、PBS缓冲液及显色底物。具体地，上述试剂盒包括如下试剂：（1）96孔聚苯乙烯微孔板；（2）AFB1单克隆抗体（Ab1），市购产品；（3）生物素标记的AFB1核酸适配体（bio-aptamer）：浓度为1μM，其核苷酸序列为：5’-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC-3’，如SEQIDNo:1所示；（4）Cy5标记的cDNA：浓度为1μM，序列为：5’-GGCCTAGCG-3’，如SEQIDNo:2所示；（5）链霉亲和素化的MNPs（SA-MNPs，MNPs为四氧化三铁磁纳米颗粒）：浓度为0.1-1mg/mL，市购产品；（6）PBS缓冲液：浓度为0.01M，市购产品；并按常规技术配制浓度为1mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲溶液；（7）显色底物：A液，浓度为5.88mM的H2O2溶液；B液，浓度为1.25mM的TMB溶液。本专利技术的另一目的是提供一种基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测方法，该方法步骤如下：（1）将生物素标记的AFB1核酸适配体与Cy5标记的cDNA按体积比1：1杂交，形成双链DNA后加入到链霉亲和素化的MNPs溶液中，以通过生物素与链霉亲和素特异性结合，aptamer/cDNA修饰到MNPs表面，得到检测探针aptamer@cDNA@MNPs；（2）将AFB1单克隆抗体用PBS缓冲溶液稀释后加入到96聚苯乙烯微孔板中，完成抗体包被；并用含牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液封闭微孔板上的非特异性活性位点；（3）向微孔板中分别加入样品溶液以及浓度梯度的AFB1标准溶液，再加入步骤（1）制得的检测探针、体积比为1：3的盐酸溶液和K4Fe(CN)6溶液进行超声反应；（4）依据不同检测要求根据AFB1标准溶液检测结果绘制标准曲线，将样品溶液检测结果对应绘制的标准曲线，即可对样品溶液中的AFB1进行检测分析。具体地，上述检测方法的步骤如下：（1）取bio-aptamer和Cy5标记的cDNA按体积比1：1杂交，形成双链DNA后加入到0.1-1mg/mL的SA-MNP溶液中，室温下孵育0.5-2h，以通过生物素与链霉亲和素特异性结合，将aptamer/cDNA修饰到MNPs表面，8000-12000r/mim下离心8-15min，洗涤3次，得到检测探针aptamer@cDNA@MNPs；（2）用0.01M的PBS缓冲溶液稀释AFB1单克隆抗体（Ab1）至0.01mg/mL，之后取200μL加入96聚苯乙烯微孔板中，4℃下反应过夜，用0.01M的PBS缓冲溶液洗涤3次，完成抗体包被；再于微孔板中加入200μL浓度为1mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲溶液，避光室温孵育1h，以封闭微孔板上的非特异性活性位点，用0.01M的PBS溶液洗洗涤3次；（3）向微孔板中分别加入200μL样品溶液、200μL浓度为10-14-10-7g/mL和0g/mL的AFB1标准溶液，室温下避光孵育0.5-2h，用0.01MPBS溶液冲洗掉多余的AFB1；于微孔板中加入步骤（1）制得的检测探针，室温下避光孵育0.5-2h，用PBS溶液冲洗掉未反应的探针，再向微孔板中加入体积比为1：3的盐酸溶液和K4Fe(CN)6溶液，超声反应20-60min；（4）依据不同检测要求根据AFB1标准溶液检测结果绘制标准曲线，将样品溶液检测结果对应绘制的标准曲线，即可对样品溶液中的AFB1进行检测分析。上述样品溶液是将样品粉粹，取2-8g样品浸泡在20-40mL体积浓度为40%的甲醇中，搅拌均匀，离心，取上清液，稀释5倍得到。其中，离心是以3000-6000r/min离心5-10min。上述步骤（4）中提及的检测要求为：光热检测、比色半定量检测及荧光检测，具体地：光热检测：用808nm的红外激光照射步骤（3）中超声反应后的微孔板，以温度计为信号读出器，通过温度与AFB1标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线，实现对AFB1快速便携检测。比色检测；向用808nm的红外激光照射步骤（3）中超声反应后的微孔板中加入双氧水溶液和TMB溶液，反应后，观察颜色变化，并且用酶标仪记录其溶液在652nm处的紫外吸收值。通过紫外吸收值与AFB1标准溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线，实现对AFB1快速半定量检测。荧光检测：将步骤（3）超声反应后的微孔板的溶液快速离心，取上清液；用荧光成像仪对上清液进行拍照。通过imageLab软件分析其荧光强度与AFB1标准溶液浓度之间的关系建立标准曲线，实现对AFB1高灵敏的精确定量检测。本专利技术先采用链霉亲和素化的MNPs为载体及前本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括AFB1单克隆抗体、生物素标记的AFB1核酸适配体、Cy5标记的cDNA和链霉亲和素化的MNPs；该链霉亲和素化的MNPs偶联生物素标记的AFB1核酸适配体与Cy5标记的cDNA杂交形成的双链DNA后得到检测探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括AFB1单克隆抗体、生物素标记的AFB1核酸适配体、Cy5标记的cDNA和链霉亲和素化的MNPs；该链霉亲和素化的MNPs偶联生物素标记的AFB1核酸适配体与Cy5标记的cDNA杂交形成的双链DNA后得到检测探针。


2.如权利要求1所述的基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的AFB1核酸适配体的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示。


3.如权利要求1所述的基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒，其特征在于，所述Cy5标记的cDNA的序列如SEQIDNo:2所示。


4.如权利要求1所述的基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括96孔聚苯乙烯微孔板、PBS缓冲液、终止缓冲液及显色底物。


5.一种基于PBNPs原位生长调控多模信号输出的黄曲霉毒素B1检测方法，其特征在于，该方法步骤如下：
（1）将生物素标记的AFB1核酸适配体与Cy5标记的cDNA按体积比1：1杂交，形成双链DNA后加入到链霉亲和素化的MNPs溶液中，以通过生物素与链霉亲和素特异性结合，aptamer/cDNA修饰到MNPs表面，得到检测探针aptamer@cDNA@MNPs；
（2）将AFB1单克隆抗体用PBS缓冲溶液稀释后加入到96聚苯乙烯微孔板中，完成抗体包被；并用含牛血清白蛋白的PBS缓冲溶液封闭微孔板上的非特异性活性位点；
（3）向微孔板中分别加入样品溶液以...

【专利技术属性】
技术研发人员：石星波，鲁迨，赵倩，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43