一种快速检测大肠杆菌O157:H7的双抗体夹心ELISA方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，以特异性识别大肠杆菌O157外膜蛋白OmpC特异性表位的单抗2G12作为包被抗体，特异性识别O157脂多糖O抗原的单抗12B1为检测抗体建立大肠杆菌O157：H7双抗体夹心ELISA方法，对测试的8株大肠杆菌O157：H7均有交叉反应，对测试的60株非O157细菌包括6大致病性大肠杆菌均无交叉反应；本发明专利技术制备了独特性的单克隆抗体，并建立了大肠杆菌O157：H7特异性双抗体夹心ELISA法，为食品中大肠杆菌O157：H7的检测提供了准确、可靠、快速的分析手段；本发明专利技术灵敏度和特异性，同时稳定性好、成本低，能同时检测大量样品，适合食品和临床样本大规模、高通量的快速检测要求，具有很高的经济价值和社会价值，值得推广和应用。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法
本专利技术涉及一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，属于免疫分析领域，具体是一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法。
技术介绍
大肠杆菌O157：H7(EscherichiacoliO157:H7)是大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌中的典型代表，对人类致病而对反刍动物如牛等无致病性，因此牛和牧场都是该致病菌的天然储藏容器。该致病菌在环境中分布广泛，容易由水、土壤、动物粪便等传播到食物链，进而进入人体并导致疾病爆发，典型症状包括肠胃炎甚至出血性腹泻和溶血性尿毒症。目前，我国对于食品中大肠杆菌O157:H7限量规定为25g样品中不得检出。大肠杆菌O157:H7等食源性致病菌的标准检测方法是传统的培养法，费时费力、成本高、专业性强，检测效率难以满足需求。免疫分析和DNA聚合酶链式反应(PCR)方法是目前主要的快速检测技术。PCR方法检测大肠杆菌O157:H7需要同时扩增多种目标片段来保证准确性，要求比较专业的操作技术避免假阳性、假阴性和气溶胶污染，依赖于贵重仪器和耗材，更适合于实验室确证和研究。但目前致病菌包括大肠杆菌O157：H7免疫检测方法主要问题之一是研究中所用抗体识别的菌体表面抗原、表位及抗体的特异性并不明确，而细菌抗原同源性复杂，从而影响方法的可靠性和实用性。本专利技术通过菌体免疫制备了大肠杆菌O157:H7单克隆抗体并发现单抗SM6E8和RCD配对建立双抗体夹心ELISA方法对大肠杆菌O157:H7的特异性较好，并通过蛋白质组、免疫亲和层析、生物质谱等技术手段鉴定了2个抗体分别识别大肠杆菌O157:H7外膜蛋白OmpC的膜外特异性loop结构和O157脂多糖的O特异性侧链，测试表明该方法对8株大肠杆菌O157:H7具有较高的灵敏度(4.57×104CFU/mL)，对测试的60株其它菌株如23株非O157大肠杆菌、沙门氏菌、柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌、变形杆菌、副溶血性弧菌、气单胞菌、单增李斯特菌等无交叉反应，可以用于在食品和临床分析中大肠杆菌O157：H7的初筛检验。
技术实现思路
针对上述缺陷，本专利技术提供了一种识别表位和检测特异性清楚的大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA检测方法，用于食品和临床中大肠杆菌O157：H7的批量、快速检测；为实现上述目的，本专利技术对制备的配对抗体SM6E8和RCD进行了抗原和表位鉴定，在分析抗原同源性、测定抗体和方法特异性的基础上，建立了一种基于单克隆抗体的检测人畜共患病原菌大肠杆菌O157：H7的特异性双抗体夹心法，具体技术方案如下：一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：以两株单克隆细胞株分别分泌的单克隆抗体2G12和单克隆抗体12B1作为配对抗体，分别用于特异性识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外特异性多肽表位和大肠杆菌O157：H7脂多糖O特异性侧链，建立大肠杆菌O157：H7双抗体夹心ELISA方法，所述单克隆细胞株包括大肠杆菌O157：H7特异性细胞株SM6E8和大肠杆菌O157：H7特异性细胞株RCD，其分泌的单克隆抗体分别对应2G12和12B1。进一步的，所述大肠杆菌O157：H7特异性细胞株SM6E8于2019年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCCNo.19164，分类命名为单克隆细胞株，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；所述大肠杆菌O157：H7特异性细胞株RCD于2019年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCCNo.19163，分类命名为单克隆细胞株，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。进一步的，所述单克隆抗体2G12用于识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外两条相邻loop结构，分别为OmpC蛋白第296-311个氨基酸，第256-268个氨基酸，关键识别表位为第302-307个氨基酸，用于特异性捕获大肠杆菌O157：H7细菌，该识别大肠杆菌O157：H7蛋白的膜外特异性片段已申请专利技术专利保护，其专利号202010490007.1，专利名称为一种菌体抗体的抗原表位鉴定方法。进一步的，ELISA方法包括如下步骤：(一)制备特异性大肠杆菌O157：H7单克隆抗体：以大肠杆菌O157：H7煮沸抗原为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选对大肠杆菌O157：H7强阳性的细胞进行亚克隆，获取大肠杆菌O157：H7特异性单克隆抗体；(二)筛选配对单克隆抗体：纯化步骤(1)中获取的大肠杆菌O157：H7特异性单克隆抗体，并分别标记辣根过氧化物酶HRP，鉴定标记成功后进行夹心法配对；(三)建立大肠杆菌O157：H7特异性夹心ELISA方法：将步骤(二)中获取的配对单克隆抗体，以2G12用作包被抗体，12B1用作检测抗体，酶标板上包被单克隆抗体2G12用于特异性捕获大肠杆菌O157：H7，并以酶标板上酶标抗体12B1-HRP与捕获的大肠杆菌O157：H7结合，底物加入后被HRP酶催化并在450nm产生吸收值，根据P/N值判定结果，其中：若大肠杆菌O157：H7被包被抗体2G12捕获并与酶标抗体12B1-HRP结合，并催化底物在450nm产生吸收值(P/N≥2.1)，判定为阳性；若大肠杆菌O157：H7浓度过低(P/N＜2.1)被判定为阴性。进一步的，所述步骤(三)具体检测步骤如下：(1)包被：用4μg/mL的2G12包被酶标板，用量100μL/孔，并于37℃温育2h；(2)洗涤：用PBST洗板三次，每次3min，用量200μL/孔，然后甩干反应板；(3)封闭：用含0.2％明胶的CBS封闭板孔，用量200μL/孔，于37℃封闭2h；(4)洗涤：同步骤(2)；(5)样品：用PBST将大肠杆菌O157：H7菌液按3倍梯度从109CFU/mL连续稀释至5645CFU/mL，另设一个PBST空白对照，每孔加入100μL样品，于37℃温育lh；(6)洗涤：同步骤(2)；(7)加2μg/mL酶标抗体12B1-HRP，用量100μL/孔，并于37℃反应1h；(8)洗涤：洗板四次；(9)显色：按照TMB与底物液比例为1:5加显色液，用量100μL/孔，显色12min；(10)终止：加终止液50μL/孔；(11)测定：用酶标仪检测OD450nm。进一步的，所述步骤(二)配对参数包括4μg/mL包被抗体2G12，包被液为pH9.6、0.01M的碳酸盐缓冲液，标品浓度10^7CFU/mL和10^6CFU/mL，标品稀释液pH7.2、0.01M的PBST，酶标抗体稀释1000倍使用。进一步的，所述步骤(三)中包被液为pH9.6、0.01M碳酸盐缓冲液，标品稀释液为pH本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：以两株单克隆细胞株分别分泌的单克隆抗体2G12和单克隆抗体12B1作为配对抗体，分别用于特异性识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外特异性多肽表位和大肠杆菌O157：H7脂多糖O特异性侧链，建立大肠杆菌O157：H7双抗体夹心ELISA方法，所述单克隆细胞株包括大肠杆菌O157：H7特异性细胞株SM6E8和大肠杆菌O157：H7特异性细胞株RCD，其分泌的单克隆抗体分别对应2G12和12B1。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：以两株单克隆细胞株分别分泌的单克隆抗体2G12和单克隆抗体12B1作为配对抗体，分别用于特异性识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外特异性多肽表位和大肠杆菌O157：H7脂多糖O特异性侧链，建立大肠杆菌O157：H7双抗体夹心ELISA方法，所述单克隆细胞株包括大肠杆菌O157：H7特异性细胞株SM6E8和大肠杆菌O157：H7特异性细胞株RCD，其分泌的单克隆抗体分别对应2G12和12B1。


2.根据权利要求1所述的一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述大肠杆菌O157：H7特异性细胞株SM6E8于2019年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCCNo.19164，分类命名为单克隆细胞株；所述大肠杆菌O157：H7特异性细胞株RCD于2019年11月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号CGMCCNo.19163，分类命名为单克隆细胞株。


3.根据权利要求1所述的一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：所述单克隆抗体2G12用于识别大肠杆菌O157：H7外膜蛋白OmpC膜外两条相邻loop结构，分别为OmpC蛋白第296-311个氨基酸，第256-268个氨基酸，关键识别表位为第302-307个氨基酸，用于特异性捕获大肠杆菌O157：H7细菌。


4.根据权利要求1所述的一种快速检测大肠杆菌O157：H7的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于：包括如下步骤：
(一)制备特异性大肠杆菌O157：H7单克隆抗体：以大肠杆菌O157：H7煮沸抗原为免疫原，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、融合，筛选对大肠杆菌O157：H7强阳性的细胞进行亚克隆，获取大肠杆菌O157：H7特异性单克隆抗体；
(二)筛选配对单克隆抗体：纯化步骤(1)中获取的大肠杆菌O157：H7特异性单克隆抗体，并分别标记辣根过氧化物酶HRP，鉴定标记成功后进行夹心法配对；
(三)建立大肠杆菌O157：H7特异性夹心ELISA方法：将步骤(二)中获取的配对单克隆抗体，以2G12用作包被抗体，12B1用作检测抗体，酶标板上包被单克隆抗体2G12用于特异性捕获大肠杆菌O157：H7，并以酶标板上酶标抗体12B1-HRP与捕获的大肠杆菌O15...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文彬，胥传来，桑雨浓，盘赛昆，刘建欣，梁夏夏，郭珊珊，刘蕾，袁倩云，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32