检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。本发明专利技术首先公开了检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条包括PVC背衬及设置在PVC背衬上的依次搭接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫上含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体，所述反应垫上依次设置相互平行的分别包被不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的检测线T

【技术实现步骤摘要】
检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用
本专利技术涉及棉酚的检测领域。更具体地，涉及检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
技术介绍
棉籽饼粕是一种营养丰富的蛋白质原料，一直作为蛋白质饲料用于畜牧养殖业中，可在一定程度上代替豆粕等常规蛋白质原料，弥补蛋白质饲料资源法的不足。但是有毒物质棉酚的存在限制了棉籽饼粕的大量使用。棉酚(gossypol)，又称棉花毒素，是一种黄色多羟基双萘醛化合物，主要分布在锦葵科植物树棉、草棉或陆地棉根皮、成熟种子、茎秆中色素腺体中。棉酚可分为左旋棉酚[(-)-棉酚]和右旋棉酚[(+)-棉酚]2种光学异构体。(+)-棉酚几乎无活性，而(-)-棉酚表现出更强的药用活性，如抗生育、抗肿瘤、抗病毒和抗菌作用。当棉酚被畜禽大量摄入时，其中含有的游离棉酚会使畜禽出现食欲减退，呼吸困难，受精率下降等症状，并通过食物链的作用，蓄积在肉、蛋、奶等食物中，间接威胁人类健康。关于测定游离棉酚的方法，目前有纸层析法、薄层层析法、比色法、气相色谱法和近红外方法等。这些方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，远不能适应于棉籽蛋白工业化生产中棉酚的快速准确的检测，严重制约了棉籽蛋白在饲料工业上的利用。因此，需要提供一种低成本、高通量、高灵敏，且适用于大量样品的快速筛查的检测游离棉酚的方法。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，以实现对游离棉酚的快速、高通量检测。本专利技术的第二个目的在于提供上述双信号胶体金免疫层析试纸条在检测待测样品中游离棉酚的应用。为达到第一个目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术首先提供一种检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条，包括PVC背衬及设置在PVC背衬上的依次搭接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述结合垫上含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体，所述反应垫上从靠近所述结合垫端到靠近所述吸水垫端依次设置相互平行的检测线T1线、检测线T2线和控制线C线，所述检测线T1线和检测线T2线分别包被不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物，所述控制线C线包被羊抗鼠IgG。进一步，所述可识别游离棉酚的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCCNo.19682的单克隆细胞株AAB1分泌产生。进一步，所述游离棉酚半抗原为半游离棉酚，其分子结构式如式I所示：进一步，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)，优选的为牛血清白蛋白(BSA)。进一步，所述游离棉酚半抗原与载体蛋白的偶联比为1:5-1:20，优选的为1:10。进一步，所述检测线T1线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.75mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm；所述检测线T2线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.25mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm。进一步，所述控制线C线包被的羊抗鼠IgG的浓度为0.15mg/mL，羊抗鼠IgG的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm。进一步，所述结合垫每立方厘米含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的量为0.0375-0.075μg；优选的为0.05μg。本专利技术进一步提供了上述检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：样品垫的制备：用含有0.5％BSA的0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS)浸泡玻璃纤维后，37℃烘干0.5-4小时，得到样品垫；结合垫的制备：将胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体均匀涂抹到玻璃纤维上，37℃烘干4-6小时，得到结合垫；反应垫的制备：将不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物分别包被在硝酸纤维素膜上形成检测线T1线和检测线T2线，将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上作为控制线C线，干燥，得到反应垫；吸水垫的制备：将吸水纸剪裁，得到吸水垫；检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的组装：将所述样品垫、结合垫、反应垫、吸水垫由一端依次黏附在PVC背衬上，即得到用于检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条。进一步，所述可识别游离棉酚的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCCNo.19682的单克隆细胞株AAB1分泌产生。进一步，所述结合垫每立方厘米含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的量为0.0375-0.075μg；优选的为0.05μg。具体的，所述胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原得到胶体金溶液；调胶体金溶液至pH8.8，搅拌下逐滴加入可识别游离棉酚的单克隆抗体，放置后加入牛血清蛋白，放置后，离心，沉淀物用硼酸盐缓冲液重悬，得到稳定的胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体。在本专利技术具体的实施方式中，所述胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原得到胶体金溶液；取10mL胶体金溶液调至pH8.8，搅拌下逐滴加入蛋白浓度为0.2mg/mL的可识别游离棉酚的单克隆抗体1mL，放置30min后加入牛血清蛋白，使蛋白的终浓度为1％，放置1h后，8000r/min离心45min，沉淀物用0.002mol/L、pH8.8的硼酸盐缓冲液10mL重悬两次，最后用该硼酸盐缓冲液1mL重悬，得到稳定的胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体。进一步，所述检测线T1线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.75mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm；所述检测线T2线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.25mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm。进一步，所述控制线C线包被的羊抗鼠IgG的浓度为0.15mg/mL，羊抗鼠IgG的包被量为0.5-1μL/cm，优选的为0.9μL/cm。进一步，所述游离棉酚半抗原为半游离棉酚，其分子结构式如式I所示：进一步，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)，优选的为牛血清白蛋白(BSA)。进一步，所述游离棉酚半抗原与载体蛋白的偶联比为1:5-1:20，优选的为1:10。具体的，所述游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的制备方法包括如下步骤：取半游离棉酚溶于甲醇中，与载体蛋白溶液混合，避光搅拌，加入氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，反应得到反应液，透析后得到游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物。在本专利技术具体的实施方式中，所述载体蛋白为BSA(牛血清白蛋白)；所述游离棉酚半抗原与BSA偶联物的制备方本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条，包括PVC背衬及设置在PVC背衬上的依次搭接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；其特征在于，所述结合垫上含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体，所述反应垫上从靠近所述结合垫端到靠近所述吸水垫端依次设置相互平行的检测线T

【技术特征摘要】
1.一种检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条，包括PVC背衬及设置在PVC背衬上的依次搭接的样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；其特征在于，所述结合垫上含有胶体金标记的可识别游离棉酚的单克隆抗体，所述反应垫上从靠近所述结合垫端到靠近所述吸水垫端依次设置相互平行的检测线T1线、检测线T2线和控制线C线，所述检测线T1线和检测线T2线分别包被不同浓度的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物，所述控制线C线包被羊抗鼠IgG。


2.根据权利要求1所述的双信号胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述可识别游离棉酚的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCCNo.19682的单克隆细胞株AAB1分泌产生。


3.根据权利要求1所述的双信号胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述游离棉酚半抗原为半游离棉酚，其分子结构式如式I所示：





4.根据权利要求1所述的双信号胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白，优选的为牛血清白蛋白。


5.根据权利要求1所述的双信号胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测线T1线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.75mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm；所述检测线T2线包被的游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的浓度为0.25mg/mL，游离棉酚半抗原与载体蛋白偶联物的包被量为0.5-1μL/cm。


6.根据权利要求1所述的双信号胶体金免疫层析试纸条，其特征在于，所述控制线C线包被的羊抗鼠IgG的浓度为0.15mg/mL，羊抗鼠IgG的包被量为0.5-1μL/cm。


7.检测游离棉酚的双信号胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
结合垫的制备：将胶体金标记的可识别游离棉酚溶液涂抹到玻璃纤维上，干燥，得到结合垫；
反应垫的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：李爱科，王丽，王永伟，王薇薇，施晶晶，何贝贝，刘宽博，宋丹，成俊林，
申请(专利权)人：国家粮食和物资储备局科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11