乙型肝炎病毒（HBV）特异性T细胞检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种HBV特异性T细胞检测方法及其应用。该发明专利技术针对现有技术只能对对应MHC分型的患者进行检测、HBV特异性T细胞频数低，很难检测到特异性T细胞的缺陷，在不构建抗原提呈细胞和antiCD28/CD49d或IL‑12的情况下，提取PBMC进行刺激，来检测HBV特异性T细胞。本发明专利技术不仅确定了试验中IL‑2的最适添加浓度和肽库的使用时机，节省了检测成本。

【技术实现步骤摘要】
乙型肝炎病毒(HBV)特异性T细胞检测方法及其应用
本专利技术涉及细胞检测领域，具体涉及乙型肝炎病毒(HBV)特异性T细胞检测方法及其应用。
技术介绍
HBV感染可导致严重肝病，包括急性和慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌。1990年至2015年之间，世界肝癌的发病率增加了75％，其中42％为HBV继发的相关肝细胞癌(HCC)。最新统计表明，病毒性肝炎已成为全球发病率和死亡率的第七大诱因，每年共计造成全球145万人死亡，其死亡率远超艾滋病毒、疟疾和结核病。因此，消除慢性HBV感染者可以有效降低危及生命的并发风险。研究表明，HBV特异性CD4+和CD8+T细胞对清除HBV至关重要。但是，在现有研究中，与HBV控制相关的决定抗原诱导的T细胞反应仍未得到确定。目前，常规的HBV体内试验多采用动物模型，但动物模型无法百分之百模拟人体清除病毒的机制，因此，对于慢性HBV感染的研究最好的实验对象为人体本身。在95％以上具有免疫能力的成年人中，HBV感染是自限性的，在急性肝炎患者中可以检测到强烈的HBV特异性T细胞反应。但相反的是，对于慢性感染患者而言，由于T细胞耗尽，很少有慢性感染患者能自发清除HBV。研究表明，慢性HBV感染患者存在对HBV的特异性免疫反应功能异常的情况。HBV特异性T细胞反应低下的严重程度主要取决于病毒血症和HBV表面抗原(HBsAg)水平，这也代表了无法控制病毒复制和感染慢性化。由于HBV慢性感染者HBV特异性T细胞的稀缺性，患者标本稀少而珍贵，所以亟需合适的HBV特异性T细胞的分布与功能的检测方法，以彻底剖析HBV慢性感染者体内HBV特异性T细胞的特点，为HBV相关预防与治疗提供相应的技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种HBV特异性T细胞检测方法；本专利技术的另一目的在于提供上述检测方法在IFN-γ细胞因子识别中的用途。本专利技术所采取的技术方案是：本专利技术的第一个方面，提供：一种HBV特异性T细胞检测方法，该检测方法包括如下步骤：分离样品中的外周血单个核细胞；培养扩增上述的外周血单个核细胞；取鼠抗人IFN-γ捕获抗体进行包被，洗涤，加入封闭液封闭；去除封闭液，加入刺激溶液和上述扩增的外周血单个核细胞，孵育，洗涤，去除液体；加入生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，孵育，去除生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，洗涤，去除液体；加入山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，孵育，去除山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，洗涤，去除液体；加入碱性磷酸酶进行显色反应，加水终止显色反应，烘干，判断T细胞肽库筛选结果；检测T细胞肽库筛选结果为阳性的T细胞分泌细胞因子的水平；其中，上述刺激溶液为肽库A溶液。进一步地，上述检测方法中设置有阴性对照；上述阴性对照的封闭液为植物血凝素；上述植物血凝素的浓度为10-20μg/mL；优选地，植物血凝素的浓度为10μg/mL。进一步地，通过上述显色反应后的斑点形成细胞数量判断上述T细胞肽库筛选结果；若显色反应后的斑点形成细胞数量为阴性对照中的斑点形成细胞数量的两倍或以上，则T细胞肽库筛选结果为阳性。进一步地，上述培养扩增上述的外周血单个核细胞包括以下步骤：取外周血单个核细胞，加入培养基A和肽库溶液，孵育；加入培养基B，孵育；加入培养基C，孵育；离心，收集沉淀的细胞，洗涤，静息，即得扩增的外周血单个核细胞；其中，加入培养基C孵育时，若上述外周血单个核细胞所占的面积为细胞所在平面面积的2/3或以上时，补加培养基C。本专利技术不需要构建额外的抗原提呈细胞。PBMC(外周血单个核细胞)在刺激10天后，可以收获足够量的HBV特异性T细胞，以进行进一步的实验。更进一步地，上述培养基A为含20％人AB血清的RPMI1640培养基；上述培养基B为含IL-7的培养基，其中，上述IL-7的浓度含量为25-50ng/mL，优选地，上述IL-7的浓度含量为25ng/mL；上述培养基C为含有IL-2的培养基，其中，上述IL-2的浓度含量为10-20ng/mL，优选地，上述IL-2的浓度含量为10ng/mL。本专利技术不需要antiCD28/CD49d或IL-12。且专利技术人发现了IL-2的最适浓度，结果表明本专利技术中的IL-2浓度足以用于细胞培养。相反，更高浓度的IL-2将无助于改善结果，反而会影响检测背景和特异性。此外，在本专利技术中所使用的肽库仅需在试验开始阶段的第一天和重新刺激的最后一天添加。确定的上述试剂量节省了检测的成本。更进一步地，上述肽库溶液为混合有构成S蛋白的重叠肽的溶液、或混合有构成C蛋白的重叠肽的溶液、或混合有构成P蛋白的重叠肽的溶液、或混合有构成X蛋白的重叠肽的溶液中的至少一种，上述肽库溶液的浓度为1-8μg/mL，优选地，上述肽库溶液的浓度为2μg/mL或8μg/mL。进一步地，上述混合有构成蛋白重叠肽的溶液可视实际情况，均分为多个溶液分别使用。在本专利技术实施例中，混合有构成P蛋白的重叠肽的溶液中的构成P蛋白的重叠肽可以均分为两部分，使混合有构成P蛋白的重叠肽的溶液变为混合有构成P1蛋白的重叠肽的溶液和混合有构成P2蛋白的重叠肽的溶液.进一步地，上述封闭液为含10％胎牛血清的RPMI1640培养基。HBV基因组包含四个开放区，它们分别编码病毒包膜(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白，每个蛋白都可以引发特定的抗HBV免疫反应。进一步地，上述细胞因子为IFN-γ。进一步地，上述样品包括脐带血、骨髓、外周血。本专利技术的第二个方面，提供：上述检测方法在IFN-γ细胞因子识别中的用途；其中，上述用途不用于疾病诊断和治疗。本专利技术的有益效果是：1.针对现有技术只能对对应MHC分型的患者进行检测、HBV特异性T细胞频数低，很难检测到特异性T细胞的缺陷，本专利技术不需要构建额外的抗原提呈细胞。PBMC(外周血单个核细胞)刺激10天后，可以收获足够量的HBV特异性T细胞，以进行进一步的实验。2.本专利技术不需要antiCD28/CD49d或IL-12。此外，本专利技术确定了IL-2的最适添加浓度，并发现高浓度的IL-2将无助于改善结果，反而会影响检测背景和特异性。此外，本专利技术中使用的肽库仅需在实验的第一天和重新刺激的最后一天添加，确定的上述试剂量也节省了检测成本。附图说明图1A是ELISPOT、本专利技术以及胞内因子染色(流式细胞术)实验示意图；图1B显示了经过HBV特异性T细胞扩增后，特异性T细胞频数从原来的不可测定转变为可检测到，“neg”代表对照；图1C和图1D显示了IFN-γ+SFC的数量与IFN-γ+CD4+或CD8+T细胞频数之间存在显著正相关；图2A显示了用不同浓度的IL-2可以取得相同的结果，图2B为图2A对应的统计图；图2C和图2D显示了新鲜标本和复苏标本以及操作者之间的差异性；图2E和图2F显示了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HBV特异性T细胞检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：/n分离样品中的外周血单个核细胞；/n培养扩增所述的外周血单个核细胞；/n取鼠抗人IFN-γ捕获抗体进行包被，洗涤，加入封闭液封闭；/n去除封闭液，加入刺激溶液和所述扩增的外周血单个核细胞，孵育，洗涤，去除液体；/n加入生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，孵育，去除生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，洗涤，去除液体；/n加入山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，孵育，去除山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，洗涤，去除液体；/n加入碱性磷酸酶进行显色反应，加水终止显色反应，烘干，判断T细胞肽库筛选结果；/n检测T细胞肽库筛选结果为阳性的T细胞分泌细胞因子的水平；/n其中，所述刺激溶液为肽库溶液。/n

【技术特征摘要】
1.一种HBV特异性T细胞检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
分离样品中的外周血单个核细胞；
培养扩增所述的外周血单个核细胞；
取鼠抗人IFN-γ捕获抗体进行包被，洗涤，加入封闭液封闭；
去除封闭液，加入刺激溶液和所述扩增的外周血单个核细胞，孵育，洗涤，去除液体；
加入生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，孵育，去除生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体，洗涤，去除液体；
加入山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，孵育，去除山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体，洗涤，去除液体；
加入碱性磷酸酶进行显色反应，加水终止显色反应，烘干，判断T细胞肽库筛选结果；
检测T细胞肽库筛选结果为阳性的T细胞分泌细胞因子的水平；
其中，所述刺激溶液为肽库溶液。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法中设置有阴性对照；所述阴性对照的刺激溶液为植物血凝素；所述植物血凝素的浓度为10-20μg/mL。


3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，通过所述显色反应后的斑点形成细胞数量判断所述T细胞肽库筛选结果；
若显色反应后的斑点形成细胞数量为阴性对照中的斑点形成细胞数量的两倍或以上，则T细胞肽库筛选结果为阳性。


4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述培养扩增所述的外周血单个核细胞包括以下步骤：
取外周血单个核细胞，加入培养基A和肽库溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：李咏茵，唐利波，易璇，郭玲，王卫彬，古书琴，温春花，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东;44