一种猪源胞内劳森菌IPMA抗原检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种猪源胞内劳森菌免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)抗原检测方法。利用纯化的重组SodC蛋白作为免疫原，制备了兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体，并检测其效价和反应原性。以猪胞内劳森菌阳性菌为包被原，制备的多克隆抗体为一抗，建立了一种胞内劳森菌IPMA抗原检测方法。本发明专利技术方法具有良好的特异性、敏感性和重复性，不需要荧光倒置显微镜、酶标仪、PCR仪等昂贵仪器，操作简便，判断更为直观，染色后的微孔板可以长时间保存，适合大量样品的筛查，为胞内劳森菌在感染细胞中的定位及检测提供了新手段。

【技术实现步骤摘要】
一种猪源胞内劳森菌IPMA抗原检测方法及其应用
本专利技术属于细菌检测
，具体涉及一种胞内劳森菌IPMA抗原检测方法及其应用。
技术介绍
猪增生性肠炎(porcineproliferativeenteritis,PPE),又称猪回肠炎，是由胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis,LI)引起的一种传染性肠道疾病。该菌通常感染保育猪群，病变部位主要发生在回肠末端，临床上以增生和黏膜增厚为主要特征，可引起猪生长发育迟滞、料肉比重下降，给猪场造成严重的经济损失。该病呈现急性型、亚急性型和慢性型三种形式，临床上以亚急性型为主，一般不会引起感染猪的死亡。该病于1931年首次报道，广泛见于欧洲、北美、澳大利亚及亚洲的一些国家，呈世界规模流行。近年来，我国规模化猪场中该病的发生率呈不断升高趋势。胞内劳森菌是严格胞内寄生菌，培养要求较高，无法在体外进行培养，鸡胚上也无法生长，需要特殊的细胞培养技术，目前国内尚无胞内劳森菌分离、培养的报道，成功检测出细胞内胞内劳森菌是该菌分离的关键。目前，国内外已经建立了该菌的PCR、qPCR、IFA等抗原检测方法。PCR虽然可以实现临床样品的快速检测，但是仅限于感染猪排菌期的粪便样品检测。此外，由于粪便中胞内劳森菌的含量不高，同时存在PCR抑制因子，因此可能造成一定的假阴性。IFA结果判读需用价格昂贵的荧光显微镜，检测结果也可能出现假阴性，没有检测出不能代表无LI，难以在所有实验室得到推广。而IPMA检测的优点则在于不需要荧光倒置显微镜、酶标仪、PCR仪等昂贵仪器，只需要简单的光学显微镜即可观察结果，操作简便，判断更为直观，特异性高，染色后的微孔板可以长时间保存，适合大量样品的筛查。本专利技术旨在建立一种针对胞内劳森菌抗原的IPMA检测方法，为后续胞内劳森菌的实验室分离鉴定提供一种有效的技术手段，从而为进一步控制和防治猪回肠炎提供一定的参考依据。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的问题，提供一种针对胞内劳森菌抗原的IPMA(免疫过氧化物酶细胞单层试验)检测方法，本专利技术方法具有操作简便，判断直观，特异性强，敏感性高，重复性好等优点，能够检测常规PCR无法检测的病料，为该病早期防控提供一种技术支持。为实现专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术的第一个目的是提供一种胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，包括以下步骤：(1)获取兔抗胞内劳森菌过氧化物歧化酶C蛋白(SodC蛋白)多克隆抗体作为一抗，HRP(辣根过氧化物酶)标记羊抗兔IgG作为二抗；(2)制备待测胞内劳森菌抗原样品；(3)制备IPMA检测反应板：将胞内劳森菌的宿主细胞接种于细胞培养板内，采用含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液培养形成单层细胞，弃去培养液，取出细胞培养板；向细胞培养板中加入步骤(2)制备的待测胞内劳森菌抗原样品，感染胞内劳森菌的宿主细胞，设置不含胞内劳森菌抗原样品的阴性对照，阴性对照孔加入与待测胞内劳森菌抗原样品等量的DMEM培养液；细胞培养板培养，培养完成后，将细胞培养板固定、清洗，得到IPMA检测反应板，备用；优选的，所述胞内劳森菌的宿主细胞为McCoy细胞，或IPEC-J2细胞，或IEC-18细胞；(4)胞内劳森菌的IPMA检测：取步骤(3)制备的IPMA检测反应板，加入体积百分比为0.5％的Triton-100溶液，室温透化，PBS清洗；将步骤(1)获取的一抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；将步骤(1)获取的二抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；每孔加入3-氨基-9-乙基咪唑(AEC)底物，室温显色，甩去AEC底物，PBS清洗，加入苏木素染色液，PBS清洗；待IPMA检测反应板彻底干燥后用光学显微镜观察结果，当待测胞内劳森菌抗原样品为阳性，则胞核呈蓝色，胞浆呈棕红色；当待测胞内劳森菌抗原样品为阴性，则胞核呈蓝色，胞浆不着色。进一步的，步骤(1)所述一抗通过以下方法制备获得：(1-1)以猪胞内劳森菌菌株弱毒疫苗培养物为模板，设计一对特异性引物进行扩增；优选的，所述特异性引物对序列如下：SF：5’-GGATCCATGGAATAAAACAGAGTATAGG-3’(SEQIDNO.1)；SR：3’-CTCGAGCTAGTTTGGTATAACACCAC-5’(SEQIDNO.2)；胞内劳森菌sodc基因全长543bp(NCBIgenbank:AB218757.1)，本专利技术以猪胞内劳森菌菌株弱毒疫苗培养物为模板，采用特异性引物截取115-543位点的氨基酸表达蛋白，软件分析显示，经本专利技术截短表达的SodC蛋白抗原性和亲水性均强于sodc基因全长表达的蛋白，因此制备的胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体特异性强，除了与胞内劳森菌发生反应外，与沙门氏菌、猪流行性腹泻病毒等常见肠道菌和病毒均不发生反应。(1-2)以pGex-6p-1为载体，连接步骤(1)扩增产物，构建pGex-6p-1-sodc重组质粒，转化BL21，得到重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21；(1-3)将步骤(1-2)得到的重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，表达胞内劳森菌SodC蛋白，离心收集上清，使用GST亲和层析柱对SodC蛋白进行纯化。优选的，所述重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21与含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基的体积比例为1:100；优选的，所述胞内劳森菌SodC蛋白表达条件为：将重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm震荡培养至OD600nm值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mMIPTG，于16℃、90r/min诱导18-24h，6000-10000rpm，4℃离心10-15min收集菌体，用PBS洗涤菌体3-5次，最后用PBS重悬沉淀，于-80℃反复冻融，冻融时间≥1h，进行超声破碎裂解，4℃，10000-12000×rpm离心20-30min,收集上清。将纯化后的胞内劳森菌SodC蛋白与油佐剂按照1:1比例进行混合，乳化后制备成免疫原，将免疫原注射大白兔，三免后测定血清效价；优选的，所述测定血清效价的方法为：SodC蛋白包被浓度为5-20ug/ml，将待检测效价血清从体积比为1：100倍比稀释到1：100×230，TMB显色后测定OD450nm处的吸光值，以待检测效价血清孔的OD450nm值/阴性血清孔OD450nm值≧2.1判为阳性；优选的，采用背部皮下多点注射免疫大白兔，免疫剂量为1mg/只，一免后第14d和21d各加强免疫一次，免疫剂量与免疫途径同首免；三免后第7天对兔子进行耳缘静脉采血，采用常规ELISA方法测定血清效价，SodC蛋白包被浓度为5-20ug/ml，将待检血清从1：100倍比稀释到1：100×230，稀释完成后，TMB显色后测定OD450nm本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)获取兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗兔IgG作为二抗；/n(2)制备待测胞内劳森菌抗原样品；/n(3)制备IPMA检测反应板：将胞内劳森菌的宿主细胞接种于细胞培养板内，采用含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液培养形成单层细胞，弃去培养液，取出细胞培养板；向细胞培养板中加入步骤(2)制备的待测胞内劳森菌抗原样品，设置不含胞内劳森菌抗原样品的阴性对照，阴性对照孔加入与待测胞内劳森菌抗原样品等量的DMEM培养液；细胞培养板培养，培养完成后，将细胞培养板固定、清洗，得到IPMA检测反应板，备用；/n优选的，所述胞内劳森菌的寄主细胞为McCoy细胞，或IPEC-J2细胞，或IEC-18细胞；/n(4)胞内劳森菌的IPMA检测：取步骤(3)制备的IPMA检测反应板，加入体积百分比为0.5％的Triton-100溶液，室温透化，PBS清洗；/n将步骤(1)获取的一抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；/n将步骤(1)获取的二抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；/n每孔加入AEC底物，室温显色，甩去AEC底物，PBS清洗，加入苏木素染色液，PBS清洗；/n待IPMA检测反应板彻底干燥后用光学显微镜观察结果，当待测胞内劳森菌抗原样品为阳性，则胞核呈蓝色，胞浆呈棕红色；当待测胞内劳森菌抗原样品为阴性，则胞核呈蓝色，胞浆不着色。/n...

【技术特征摘要】
1.一种胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)获取兔抗胞内劳森菌SodC蛋白多克隆抗体作为一抗，HRP标记羊抗兔IgG作为二抗；
(2)制备待测胞内劳森菌抗原样品；
(3)制备IPMA检测反应板：将胞内劳森菌的宿主细胞接种于细胞培养板内，采用含有体积比为10％FBS的DMEM细胞培养液培养形成单层细胞，弃去培养液，取出细胞培养板；向细胞培养板中加入步骤(2)制备的待测胞内劳森菌抗原样品，设置不含胞内劳森菌抗原样品的阴性对照，阴性对照孔加入与待测胞内劳森菌抗原样品等量的DMEM培养液；细胞培养板培养，培养完成后，将细胞培养板固定、清洗，得到IPMA检测反应板，备用；
优选的，所述胞内劳森菌的寄主细胞为McCoy细胞，或IPEC-J2细胞，或IEC-18细胞；
(4)胞内劳森菌的IPMA检测：取步骤(3)制备的IPMA检测反应板，加入体积百分比为0.5％的Triton-100溶液，室温透化，PBS清洗；
将步骤(1)获取的一抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；
将步骤(1)获取的二抗稀释后，加入IPMA检测反应板，孵育，PBS清洗；
每孔加入AEC底物，室温显色，甩去AEC底物，PBS清洗，加入苏木素染色液，PBS清洗；
待IPMA检测反应板彻底干燥后用光学显微镜观察结果，当待测胞内劳森菌抗原样品为阳性，则胞核呈蓝色，胞浆呈棕红色；当待测胞内劳森菌抗原样品为阴性，则胞核呈蓝色，胞浆不着色。


2.根据权利要求1所述的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法，其特征在于，步骤(1)所述一抗通过以下方法制备获得：
(1-1)以猪胞内劳森菌菌株弱毒疫苗培养物为模板，设计特异性引物对进行扩增；
优选的，所述特异性引物对序列如下：
SF：5’-GGATCCATGGAATAAAACAGAGTATAGG-3’(SEQIDNO.1)；
SR：3’-CTCGAGCTAGTTTGGTATAACACCAC-5’(SEQIDNO.2)；
(1-2)以pGex-6p-1为载体，连接步骤(1)扩增产物，构建pGex-6p-1-sodc重组质粒，转化BL21，得到重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21；
(1-3)将步骤(1-2)得到的重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，表达胞内劳森菌SodC蛋白，离心收集上清，使用GST亲和层析柱对SodC蛋白进行纯化；
将纯化后的胞内劳森菌SodC蛋白与油佐剂按照体积比为1:1比例进行混合，乳化后制备成免疫原，将免疫原注射大白兔，三免后测定血清效价；
优选的，所述测定血清效价的方法为：SodC蛋白包被浓度为5-20ug/ml，将待检测效价血清稀释到1：100×230，TMB显色后测定OD450nm处的吸光值，以待检测效价血清孔的OD450nm值/阴性血清孔OD450nm值≧2.1判为阳性；
优选的，步骤(1-3)中所述胞内劳森菌SodC蛋白表达条件为：将重组菌pGex-6p-1-sodc/BL21接种到含氨苄青霉素和氯霉素的LB液体培养基中，37℃、180rpm震荡培养至OD600nm值为0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mMIPTG，于16℃、90r/min诱导18-24h，6000-10000rpm、4℃离心10...

【专利技术属性】
技术研发人员：范红结，李敏雪，肖宁，李剑男，
申请(专利权)人：南京农业大学，南京昌吉生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32