用于检测基因融合的靶向测序方法技术

本发明专利技术一种用于检测基因融合的靶向测序方法，其包括提取样本的总RNA，反转录得到cDNA，然后片段化为150‑250pb的片段、并在末端修复、加A，连接测序接头，得到预文库；利用封闭阻断剂封闭预文库，然后使特定的探针组与预文库杂交，获得捕获片段，经PCR富集和纯化后质检，得到测序文库；利用二代测序对测序文库进行测序，获得基因融合信息。本发明专利技术的方法在使用更少的探针和更低的测序数据量时，仍然能够保持高的捕获效率，获得比传统捕获更多的阳性Reads，减少了探针合成和测序成本，提高了检测灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
用于检测基因融合的靶向测序方法
本专利技术涉及靶向方法，更具体地，本专利技术涉及一种用于融合基因检测的高通量靶向测序方法。
技术介绍
通过染色体重排，例如异位、缺失、插入，癌细胞常常发生基因融合事件。随着对融合基因的临床重要性的认识日益增加，融合基因的精确诊断也越来越受到重视。目前，已有多种抑制融合基因的肿瘤靶向治疗药物，包括伊马替尼/BCR-ABL1、克唑替尼/EML4-ALK和拉罗替尼/NTRK融合等。融合基因的快速、准确诊断不但可以对癌症进行诊断和分型，还能够为后续的治疗提供必要信息。目前，融合基因诊断主要包括荧光原位杂交(FISH)、IHC等方法，然而，这些检测方法的通量通常较低，依赖检验人员的经验，只适用于已知的融合亚型。有报道表明，使用IHC检测NTRK3融合的灵敏度降低，只有79％[IdentifyingpatientswithNTRKfusioncancer.]。多种新兴的融合基因检测技术虽然避免了技术人员的主观判断，具有更高的通量和检测灵敏度，例如Nanostring(ncounterVantage3DTMAssays)和AgenaMassArray，但它们都不能发现新的融合亚型[OverviewofFusionDetectionStrategiesUsingNext-GenerationSequencing]。此外，基于下一代测序的全转录组测序成本较高，且不能兼容临床样本、而多重扩增子靶向测序技术假阳性率较高、需要事先建立人群基线，利用生物信息学方法过滤低置信度的结果。r>
技术实现思路
针对现有技术中的至少部分技术问题，本专利技术提供一种用于检测基因融合的靶向测序方法。与传统探针设计相比，本专利技术的探针与目标外显子区域具有更高的结合效率，同时探针数量更少，覆盖区间更小，成本更低。本专利技术的用于检测基因融合的靶向测序方法，其包括以下步骤：(1)预文库构建，其包括提取样本的总RNA，反转录得到cDNA，然后片段化为150-250pb的片段、并在末端修复、加A，连接测序接头，得到预文库；(2)利用封闭阻断剂封闭所述预文库，然后使探针组与所述预文库杂交，获得捕获片段，经PCR富集和纯化后质检，得到测序文库；(3)利用二代测序对所述测序文库进行测序，获得基因融合信息；其中，所述探针组由能够与基因A各外显子的5’末端和/或3’末端互补的第一探针以及能够与基因B各外显子的5’末端和/或3’末端互补的第二探针组成。根据本专利技术所述的靶向测序方法，优选地，5’末端是指外显子5’端第1个碱基至第120个碱基之间的片段，3’末端是指外显子3’端最后1个碱基至倒数第120个碱基之间的片段。根据本专利技术所述的靶向测序方法，优选地，所述基因A为5’伴侣基因，且所述第一探针与所述5’伴侣基因的各外显子的3’末端互补；所述基因B为3’伴侣基因，且所述第二探针与所述3’伴侣基因的5’末端互补。根据本专利技术所述的靶向测序方法，优选地，所述第一探针和所述第二探针分别为5’端生物素修饰的探针。根据本专利技术所述的靶向测序方法，优选地，所述步骤(1)为利用总RNA进行文库构建，并不去除核糖体RNA。根据本专利技术所述的靶向测序方法，优选地，所述步骤(1)中，在连接测序接头后进一步包括PCR富集和纯化步骤。根据本专利技术所述的靶向测序方法，优选地，步骤(2)的杂交步骤中，所述预文库为多个不同的预文库。本专利技术通过优化探针设计，减少了探针数量，并同时通过优化杂交和探针标记物结构提高捕获效果，从而使本专利技术在使用更少的探针和更低的测序数据量时，获得比传统捕获效率更高更多的阳性Reads，减少了探针合成和测序成本，大大提高了检测灵敏度。此外，不需要融合基因的先验知识，能够对未知融合亚型进行检测。附图说明图1为本专利技术示例性融合基因检测的流程图。图2为本专利技术的一种示例性探针设计方法与传统方法的比较示意图。图3为探针与目的片段不同结合长度对结合效率的影响。图4为本专利技术对ALK转录本进行探针设计的示意图。图5为本专利技术设计的EML:exon13/ALK:exon20融合探针的示意图。具体实施方式现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。本专利技术提供用于检测基因融合的靶向测序方法，本文有时简称“本专利技术的靶向测序方法”。其中，基因融合包括基因A和基因B两个基因之间的融合，还包括三个或更多个基因之间，例如三个基因之间的融合。本专利技术的基因融合优选不同基因的外显子之间发生的融合，不包括在来源的于不同基因的外显子内部发生的融合。融合基因之间可相互称作对方的伴侣基因。本专利技术的靶向测序方法一般包括以下步骤：(1)预文库构建，其包括提取样本的总RNA，反转录得到cDNA，然后片段化为150-250bp的片段、并在末端修复、加A，连接测序接头，得到预文库；(2)利用封闭阻断剂封闭所述预文库，然后使探针组与所述预文库杂交，获得捕获片段，经PCR富集和纯化后质检，得到测序文库；(3)利用二代测序对所述测序文库进行测序，获得基因融合信息。本专利技术的步骤(1)为预文库构建步骤。其一般总RNA提取、反转录为cDNA、片段化和测序接头连接。可选地，在连接测序接头后进一步包括富集步骤。本专利技术设计的方法不会受到核糖体RNA的影响。因此，在总RNA进行文库构建时，可不必除去核糖体RNA。本专利技术的片段化可用已知方法进行，例如离子片段化或超声波片段化，只要能够得到150-250bp的片段即可。本专利技术的步骤(2)为构建测序文库的步骤，其包括利用封闭阻断剂封闭预文库，然后使探针组与预文库杂交，从而获得捕获片段，随后经PCR富集和纯化后质检，得到测序文库。本专利技术的封闭阻断剂可使用已知任意阻断剂。优选使用专利技术人设计的通用阻断剂。本专利技术的通用阻断剂由两条含有天然核苷酸和人工核苷酸的寡核苷酸组成，并且不含有Index序列(索引序列)。优选地，在通用阻断剂的3’端设计间隔臂，用于阻止3’端外切酶和3’端聚合酶发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测基因融合的靶向测序方法，其特征在于，所述基因融合包括基因A和基因B之间的融合，所述靶向测序方法包括以下步骤：/n(1)预文库构建，其包括提取样本的总RNA，反转录得到cDNA，然后片段化为150-250pb的片段、并在末端修复、加A，连接测序接头，得到预文库；/n(2)利用封闭阻断剂封闭所述预文库的重复区及接头序列，然后使探针组与所述预文库杂交，通过链霉亲和素磁珠捕获探针结合的目标区域片段，经PCR富集和纯化后质检，得到测序文库；/n(3)利用二代测序对所述测序文库进行测序，获得基因融合信息；/n其中，所述探针组包含能够与基因A各外显子的5’末端和/或3’末端互补的第一探针以及能够与基因B各外显子的5’末端和/或3’末端互补的第二探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测基因融合的靶向测序方法，其特征在于，所述基因融合包括基因A和基因B之间的融合，所述靶向测序方法包括以下步骤：
(1)预文库构建，其包括提取样本的总RNA，反转录得到cDNA，然后片段化为150-250pb的片段、并在末端修复、加A，连接测序接头，得到预文库；
(2)利用封闭阻断剂封闭所述预文库的重复区及接头序列，然后使探针组与所述预文库杂交，通过链霉亲和素磁珠捕获探针结合的目标区域片段，经PCR富集和纯化后质检，得到测序文库；
(3)利用二代测序对所述测序文库进行测序，获得基因融合信息；
其中，所述探针组包含能够与基因A各外显子的5’末端和/或3’末端互补的第一探针以及能够与基因B各外显子的5’末端和/或3’末端互补的第二探针。


2.根据权利要求1所述的靶向测序方法，其特征在于，5’末端是指外显子5’端第1个碱基至第120个碱基之间的片段，3’末端是指外显子3’端最后1个碱基至倒数第120个碱基之间的片段。

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【专利技术属性】
技术研发人员：陈文浩，韩营民，卢亚明，
申请(专利权)人：伯科生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32