一种适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法与试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法，所述方法包括：S1、将动物组织脱水后冷冻固定，然后切片；S2、向步骤S1所得组织切片上添加固定液，使组织切片完全被固定液浸润，固定结束后洗去组织切片表面固定液，即得适用于荧光成像与转录组测序的组织样本；所述固定液的配制方法包括：将3,3'‑二硫代二丙酸双(N‑羟基琥珀酰亚胺酯)溶解于DMSO中获得交联剂溶液，然后将交联剂溶液与无水乙醇、PBS缓冲液混合得到固定液。本发明专利技术还提供了与上述方法配套的试剂盒。本发明专利技术可同时保持动物组织切片的结构与细胞形态、荧光蛋白信号、单个细胞内RNA的完整性，与荧光成像技术和转录组技术兼容。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法与试剂盒
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法与试剂盒。
技术介绍
基于荧光蛋白的分子探针和标记方法已成为活细胞或活体内动态成像研究生物大分子或细胞功能的重要工具，荧光蛋白标记已经成为当代生物科学最重要、最常用的方法之一。对基因组的解码一直是现代生命科学的主流，mRNA被认为是DNA与蛋白质之间生物信息传递的一个“桥梁”,而所有表达基因的身份以及其转录水平,综合起来被称作转录组(Transcriptome)(引自《转录组研究新技术：RNA-Seq及其应用》)。转录组研究能够从整体水平研究基因功能以及基因结构,揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中的分子机理。理解器官功能、发育和疾病需要将分子、细胞类型与形态学、生理学和行为相关联。因此，在生物组织原位环境下同时获取细胞的位置、形态和全转录组信息对于理解细胞的身份和功能至关重要。荧光成像和高通量测序技术结合产生了十分前沿的带空间分辨的转录组学方法，这种方法有望实现这一目标，获取细胞在组织中定位的同时，检测其形态、功能或相关性。临床和基础研究中的生物组织荧光成像需要将组织进行切片，再将目标细胞或组织结构进行荧光标记，在空间转录组技术中，从组织到切片再到目标细胞的标记及获取的过程越快，则对mRNA的保存越有利。为了尽可能地保持RNA的完整性，目前普遍使用的方法是对新鲜的组织进行速冻后冰冻切片，冰冻切片可很好地保持RNA的完整性。然而，目标细胞的染色标记通常比较耗时，而痕量的RNase也会导致RNA的降解。因此，为了避免染色过程中RNA的降解，利用荧光蛋白报告转基因动物标记小鼠特定的目标细胞具有低毒性、高亮度、稳定遗传、高通量标记等优点，同时省去了对切片进行染色的实验步骤。然而，我们发现目前没有同时保持切片形态、荧光信号与RNA完整性的方法。临床上的活检和手术标本通常用福尔马林固定保存,基础研究的动物组织通常使用4％多聚甲醛固定后进行下游的蛋白或核酸研究。生物组织用福尔马林或者4％多聚甲醛固定后切片是临床和基础研究的重要方法，这种方法能很好地保存组织的形态、荧光和抗原，然而，这种样本处理方法与转录组技术不兼容，因为福尔马林或者4％多聚甲醛会使RNA裂解，而且福尔马林或者4％多聚甲醛强烈的交联作用使得RNA难以提取。其他组织固定的方法，如甲醇、乙醇、氯仿、Methacarn以及RNAlater等有机试剂固定荧光蛋白报告转基因动物器官虽然能一定程度上保持RNA完整性，但却会淬灭内源性荧光蛋白信号。液氮、干冰速冻能很好地保持RNA的完整性，却会导致荧光信号严重弥散和组织形态的显著改变。在这里，我们展示了能让完整器官进行冰冻切片后，组织结构和细胞形态无改变，并且能同时保存内源性荧光蛋白和RNA的冰冻切片技术，可以对生物样本既进行荧光成像又进行转录组分析。
技术实现思路
针对现有技术中的上述缺陷，本专利技术的主要目的在于提供一种适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法与试剂盒，本专利技术能够同时保持动物组织切片的结构与细胞形态、荧光蛋白信号、RNA和DNA信息的完整性，适用于荧光蛋白报告转基因动物的完整器官三维结构成像与单细胞转录组测序检测。为了达到上述目的，本专利技术第一方面提供了一种适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法，所述方法包括：S1、将动物组织脱水后冷冻固定，然后切片；S2、向步骤S1所得组织切片上添加固定液，使组织切片完全被固定液浸润，固定结束后洗去组织切片表面固定液，即得适用于荧光成像与转录组测序的组织样本；所述固定液的配制方法包括：将3,3'-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解于DMSO中获得交联剂溶液，然后将交联剂溶液与无水乙醇、PBS缓冲液混合得到固定液。本专利技术以3,3'-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)(DSP)作为切片固定所需的交联剂；以DMSO作为交联剂溶解液保证交联剂溶解性的同时提供一种类似疏水的环境阻止荧光蛋白被溶解；以无水乙醇作为固定渗透液，具有透化作用，促进交联剂渗入细胞内与蛋白发生交联反应，固定得到的切片很好地保存了组织的形态和荧光蛋白信号，并且DNA、RNA完整性极好且易于提取。本专利技术可以对荧光蛋白报告转基因动物器官进行连续冰冻切片、固定、对完整切片包括荧光蛋白标记的目标细胞或结构进行成像，然后进行下游的基因组、转录组分析。优选的，所述动物组织采用新鲜的动物组织。所述动物组织带有荧光。具体的，所述动物组织内的荧光蛋白可以是自身的，也可以是外源性的。例如，在本专利技术的几个实施例中，转基因小鼠带荧光是小鼠组织本身带荧光；在本专利技术的另外几个实施例中，小鼠组织带荧光是将体外带荧光的细胞打入到小鼠体内后取小鼠组织的结果。更加优选的，本方法适用于所有荧光蛋白信号的保持，在本专利技术的几个实施例中，列举了绿色、黄色、红色荧光蛋白保持效果，基于类似的机理，荧光蛋白并不局限于实施例中列举出的几种，其他荧光蛋白(例如蓝色波段荧光蛋白)也能达到类似的荧光保持效果。更加优选的，本方法适用于多种动物组织，所述动物组织可以是肝、脑、脾脏、心脏、肾脏、肺脏、胰腺、小肠、大肠、淋巴结、皮肤等组织，在本专利技术的几个实施例中，列举出了肝脏、脑、脾脏、肾脏、肺脏、胰腺、小肠、大肠组织切片样本制备方法，但基于类似的机理，动物组织并不局限于实施例中列举出的几种。优选的，所述交联剂溶液中3,3'-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)浓度为1～5mg/ml。更加优选的，所述交联剂溶液中3,3'-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)浓度为1～3mg/ml。具体的，本专利技术采用的交联剂溶液可以现配现用，也可配置好后于-80℃左右保存，待需要时取出使用。优选的，所述PBS缓冲液为0.1×PBS，pH＝6-8。优选的，以占所述固定液的体积百分比计，DMSO占比30～60％，无水乙醇占比10～50％，PBS缓冲液占比30～50％。更加优选的，以占所述固定液的体积百分比计，DMSO占比30～40％，无水乙醇占比20～40％，PBS缓冲液占比30～40％。优选的，本专利技术中采用的试剂应严格控制RNase，所述PBS缓冲液灭活RNase后使用，所述DMSO和无水乙醇为生物纯级别。具体的，所述灭活RNase方式可以是向配好的溶液里面加RNaseinhibitor，或者向PBS中加0.1％DEPC然后灭菌。优选的，上述组织制备方法中，向步骤S1所得组织切片上滴加固定液，所述滴加过程在温度-30～0℃下进行。具体操作方法可以是在对应温度条件的冷冻箱中向组织切片上滴加固定液。优选的，上述组织制备方法中，滴加固定液至所述组织切片完全被固定液浸润，然后置于温度10～35℃下放置5～10min，固定结束。优选的，上述组织制备方法中，固定结束后用PBS溶液洗掉切片表面固定液后即得组织样本，所述组织样本用来进行荧光成像和DNA、RNA提取。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法，所述方法包括：/nS1、将动物组织脱水后冷冻固定，然后切片；/nS2、向步骤S1所得组织切片上添加固定液，使组织切片完全被固定液浸润，固定结束后洗去组织切片表面固定液，即得适用于荧光成像与转录组测序的组织样本；/n所述固定液的配制方法包括：将3,3'-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解于DMSO中获得交联剂溶液，然后将交联剂溶液与无水乙醇、PBS缓冲液混合得到固定液。/n

【技术特征摘要】
1.一种适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法，所述方法包括：
S1、将动物组织脱水后冷冻固定，然后切片；
S2、向步骤S1所得组织切片上添加固定液，使组织切片完全被固定液浸润，固定结束后洗去组织切片表面固定液，即得适用于荧光成像与转录组测序的组织样本；
所述固定液的配制方法包括：将3,3'-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解于DMSO中获得交联剂溶液，然后将交联剂溶液与无水乙醇、PBS缓冲液混合得到固定液。


2.根据权利要求1所述的适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法，其特征在于：所述交联剂溶液中3,3'-二硫代二丙酸双(N-羟基琥珀酰亚胺酯)浓度为1～5mg/ml。


3.根据权利要求1所述的适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法，其特征在于：所述PBS缓冲液为0.1×PBS，pH＝6-8。


4.根据权利要求1-3任一项权利要求所述的适用于荧光成像与转录组测序的组织样本制备方法，其特征在于：以占所述固定液的体积百分比计，DMSO占比30～60％，无水乙醇占比10～50％，PBS缓冲液占比30～50％。


5....

【专利技术属性】
技术研发人员：张智红，黄松林，骆清铭，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42