一种快速检测乳制品中β-乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种β‑乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法，属于生物免疫分析领域。该方法以玻碳电极为基础电极，并对其进行聚合和活化预处理，采用聚酰胺‑胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰玻碳电极，然后滴涂纳米金溶液，经吸附作用固定于修饰电极上，β‑乳球蛋白抗体通过修饰过的电极更好地与在电极表面的羧基进行结合固定，制备成纳米免疫传感器。该方法灵敏度高、精确度高、特异性强，可用于检测乳制品中的β‑乳球蛋白，在抗原性检测领域具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测乳制品中β-乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备及其检测方法
本专利技术属于免疫分析领域，具体涉及一种β-乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备方法及其检测方法。
技术介绍
乳制品富含蛋白质及多种矿物质，但其是一类容易引起过敏的食物，可导致消化系统或全身性的变态反应。牛乳蛋白过敏(cowmilkproteinallergy，CMPA)是指由牛奶蛋白引起的异常或过强的免疫反应，常见的表现形式有荨麻疹和特应性皮炎，常在儿童人群中发病，发病率大约为0.3％-2％。CMPA主要致病原因是以其中β-乳球蛋白作为常见过敏原而引起的，因为人乳中不含有β-乳球蛋白，因此它也被认为是最主要的牛乳过敏原之一。有研究表明，82％的牛乳过敏患者对β-乳球蛋白过敏。目前婴幼儿对乳制品过敏现象越来越多，因此准确检测其中过敏原尤为重要。当前乳制品中的定量检测的方法主要有酶联免疫法和高效液相色谱法，高效液相仪器价格昂贵，成本较大，酶联免疫法操作相较繁琐，操作条件要求严格，重现性有待提高。因此当前国内外都致力于开发高灵敏、快速和重复性好的β-乳球蛋白检测方法，为后续脱除乳制品中β-乳球蛋白过敏原工作提供更加精准便捷的方法。
技术实现思路
本专利技术为解决上述问题的不足，提供一种用于快速检测β-乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备及其检测方法，可以检测乳制品中的β-乳球蛋白含量，其优点既具备了高效、高灵敏，抗原抗体还能较好的特异性结合，同时又方便携带实现现场检测。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现:本专利技术一种快速检测乳制品中β-乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备方法，其采用玻碳电极为工作电极，首先对其进行聚合和活化预处理，随后采用聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰玻碳电极，再滴涂纳米金溶液，经氨基的吸附偶联作用将β-乳球蛋白抗体固定在玻碳电极表面制得β-乳球蛋白纳米免疫传感器。所述的快速检测乳制品中β-乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备方法，其包括以下步骤：a.电极预处理采用粒径为0.05μm的氧化铝抛光粉将玻碳电极于抛光绒布上打磨成镜面，冲洗后依次在体积分数50％的硝酸溶液、丙酮和超纯水中超声处理2min，氮气吹干，得到裸玻碳电极，并与Ag/AgCl电极和铂丝电极组合建立电化学三电极系统。b.聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰材料的制备将0.01g聚酰胺-胺溶解在5mL甲醇中，超声处理5min，制得聚酰胺-胺溶液，并于4℃条件下保存；准确称取0.01g羧基化多壁碳纳米管，溶解到10mLN,N二甲基甲酰胺中，经超声10min，制得均匀分散的羧基化多壁碳纳米管悬浮液。移取6mL羧基化多壁碳纳米管悬浮液加入4mL聚酰胺-胺溶液中，随后超声处理20min，制得聚酰胺-胺-羧基化多壁碳纳米管悬浮液，于4℃条件下保存待用，得到聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰材料。c.纳米金制备分别配制质量分数为0.01％氯金酸和1％的柠檬酸三钠溶液，取100ml氯金酸溶液于锥形瓶中搅拌加热至沸腾，保持沸腾状态，迅速加入2-4ml柠檬酸三钠溶液,短时间内颜色由浅黄色变为灰黑色最终变成酒红色，持续搅拌15min不褪色，冷却后置于玻璃容器，4℃保存，得到纳米金溶液。d.免疫传感器制备以步骤a处理得到的玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，应用三电极系统，其中后续滴涂操作均在玻碳电极表面进行，设置工作电压为-1.5V～+0.8V之间，扫描速度为50mV/s，在新鲜配制的1mmol/L对氨基苯甲酸溶液中循环伏安扫描15-20圈，超纯水冲洗晾干，在其表面滴加5μL新鲜配制的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)混合溶液活化1h，随后在表面滴5-10μL由步骤b得到的聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰材料，于室温晾干，再在电极表面滴加2-4μL步骤c得到的纳米金溶液，得到修饰电极，室温晾干，随后在电极表面滴加5-10μLβ-乳球蛋白抗体，37℃恒温恒湿条件下孵育1h，β-乳球蛋白抗体经聚酰胺-胺树枝状大分子中氨基固定在修饰电极表面，最后滴加5μL质量分数为1％的牛血清白蛋白，4℃下封闭30min，超纯水冲洗后晾干得到β-乳球蛋白纳米免疫传感器，于4℃保存备用。优选的，所述的快速检测乳制品中的β-乳球蛋白的纳米免疫传感器制备方法，步骤c中纳米金溶液制备的具体内容为：分别配制质量分数为0.01％氯金酸和1％的柠檬酸三钠溶液，取100ml氯金酸溶液于锥形瓶中搅拌加热至沸腾，保持沸腾状态，迅速加入2.5ml柠檬酸三钠溶液,短时间内颜色由浅黄色变为灰黑色最终变成酒红色，持续搅拌15min不褪色，室温冷却后于玻璃容器中4℃条件下保存。优选的，所述的快速检测乳制品中的β-乳球蛋白的纳米免疫传感器制备方法，所述步骤d中具体步骤内容为：所述步骤a处理得到的玻碳电极与Ag/AgCl电极和铂丝电极组合建立三电极系统，其中以玻碳电极为工作电极，设置工作电压为-1.5V～+0.8V之间，扫描速度为50mV/s，在新鲜配制的浓度为1mmol/L对氨基苯甲酸溶液中采用循环伏安法扫描15圈，超纯水冲洗晾干，在其表面滴加5μL新鲜配制的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)混合溶液活化1h，随后在表面滴6μL由步骤b得到的聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰材料，于室温晾干，再在电极表面滴加3μL权利2步骤c得到的纳米金溶液，得到修饰电极，室温晾干。随后再滴加5μLβ-乳球蛋白抗体，37℃恒温恒湿条件下孵育1h，β-乳球蛋白抗体经聚酰胺-胺树枝状大分子中氨基固定在修饰电极表面，最后滴加5μL质量分数为1％的牛血清白蛋白，4℃下封闭30min，超纯水冲洗后晾干得到β-乳球蛋白纳米免疫传感器，于4℃保存备用。一种用于β-乳球蛋白检测的纳米免疫传感器的检测方法，其包括以下步骤：m1.标准曲线采用0.01M浓度的pH值为7.4的PBS缓冲溶液将β-乳球蛋白标准品稀释为不同浓度梯度，并将其各个梯度溶液滴涂在β-乳球蛋白纳米免疫传感器上，37℃恒温恒湿条件下孵育30min，以此为工作电极，与Ag/AgCl电极和铂丝电极组成三电极系统，在电压-0.2V～+0.6V区间内，以50mV/s的扫速在1.0mmol/LK3[Fe(CN)6]+0.1mol/LKCl+0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.0)的测试底液中进行差分脉冲伏安法检测，记录各个浓度梯度的峰电流响应值，分析峰电流值与对应的β-乳球蛋白浓度的线性关系，并根据其线性关系建立β-乳球蛋白标准曲线以及回归方程。m2.样品测定将牛奶和奶粉预处理后稀释一定倍数，滴涂在β-乳球蛋白纳米免疫传感器表面，结合三电极电化学分析系统测定样品的差分脉冲图，测量3次记录峰值，将得到得峰电流值带入回归方程求得样品浓度。上述用于β-乳球蛋白检测的纳米免疫传感器的检测方法，其步骤m2中待测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速检测乳制品中β-乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，采用玻碳电极为工作电极，首先对其进行聚合和活化预处理，随后采用聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰玻碳电极，再滴涂纳米金溶液，经氨基的吸附偶联作用将β-乳球蛋白抗体固定在玻碳电极表面制得β-乳球蛋白纳米免疫传感器。/n

【技术特征摘要】
1.一种快速检测乳制品中β-乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，采用玻碳电极为工作电极，首先对其进行聚合和活化预处理，随后采用聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰玻碳电极，再滴涂纳米金溶液，经氨基的吸附偶联作用将β-乳球蛋白抗体固定在玻碳电极表面制得β-乳球蛋白纳米免疫传感器。


2.如权利1所述的一种快速检测乳制品中β-乳球蛋白的纳米免疫传感器的制备方法，其特征是包括以下具体步骤：
a.电极预处理
采用粒径为0.05μm的氧化铝抛光粉将玻碳电极于抛光绒布上打磨成镜面，冲洗后依次在体积分数50％的硝酸溶液、丙酮和超纯水中超声处理2min，氮气吹干，得到裸玻碳电极，并与Ag/AgCl电极和铂丝电极组合建立电化学三电极系统；
b.聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰材料的制备
将0.01g聚酰胺-胺溶解在5mL甲醇中，超声处理5min，制得聚酰胺-胺溶液，并于4℃条件下保存；准确称取0.01g羧基化多壁碳纳米管，溶解到10mLN,N二甲基甲酰胺中，经超声10min，制得均匀分散的羧基化多壁碳纳米管悬浮液；
移取6mL羧基化多壁碳纳米管悬浮液加入4mL聚酰胺-胺溶液中，随后超声处理20min，制得聚酰胺-胺-羧基化多壁碳纳米管悬浮液，于4℃条件下保存待用，得到聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰材料；
c.纳米金制备
分别配制质量分数为0.01％氯金酸和1％的柠檬酸三钠溶液，取100ml氯金酸溶液于锥形瓶中搅拌加热至沸腾，保持沸腾状态，迅速加入2-4ml柠檬酸三钠溶液,短时间内颜色由浅黄色变为灰黑色最终变成酒红色，持续搅拌15min不褪色，冷却后置于玻璃容器，4℃保存，得到纳米金溶液；
d.免疫传感器制备
以步骤a处理得到的玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，应用三电极系统，其中后续滴涂操作均在玻碳电极表面进行，设置工作电压为-1.5V～+0.8V之间，扫描速度为50mV/s，在新鲜配制的1mmol/L对氨基苯甲酸溶液中循环伏安扫描15-20圈，超纯水冲洗晾干，在其表面滴加5μL新鲜配制的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)混合溶液活化1h，随后在表面滴5-10μL由步骤b得到的聚酰胺-胺树枝状大分子结合多壁碳纳米管修饰材料，于室温晾干，再在电极表面滴加2-4μL步骤c得到的纳米金溶液，得到修饰电极，室温晾干，随后在电极表面滴加5-10μLβ-乳球蛋白抗体，37℃恒温恒湿条件下孵育1h，β-乳球蛋白抗体经聚酰胺-胺树枝状大分子中氨基固定在修饰电极表面，最后滴加5μL质量分数为1％的牛血清白蛋白，4℃下封闭30min，超纯水冲洗后晾干得到β-乳球蛋白纳米免疫传感器，于4℃保存备用。


3.如权利2所述的快速检测乳制品中的β-乳球蛋白的纳米免疫传感器制备方法，特征在于步骤c中纳米金溶液制备的具体内容为：
分别配制质量分数为0.01％氯金酸和1％的柠檬酸三钠溶液，取100ml氯金酸溶液于锥形瓶中搅拌加热至沸腾，保持沸腾状态，迅速加入2.5ml柠檬酸三钠溶液,短时间内颜色由浅黄色变为灰黑色最终变成酒红色，持续搅拌15min不褪色，室温冷却后于玻...

【专利技术属性】
技术研发人员：李朝旭，李书国，张天博，申雪然，凌森，郝雅茹，
申请(专利权)人：河北三元食品有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13