一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用，属于生物工程技术领域。所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶，包括将带有连接肽的碳水化合物结合模块与几丁质酶Chit46的C端串联构成的融合几丁质酶。本发明专利技术首次成功将融合了CBM的几丁质酶Chit46‑CBM3、Chit46‑CBM6和Chit46‑CBM26应用于虾壳废弃物回收。融合了CBM后，虾壳中的几丁质能够直接被融合几丁质酶水解，避免了传统工艺中强碱试剂的使用以及复杂的预处理步骤。

【技术实现步骤摘要】
一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用
本专利技术属于生物工程
，特别涉及一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶及其制备方法与应用。
技术介绍
广东省是中国的水产大省，据统计，2016年广东水产品生产总量达到882万吨，其中包括了多种虾蟹等，仅虾产量就近100万吨。虾可食用部分不到50％，虾仁加工过程中会产生大量的虾头、虾壳等废弃物，虾头就占全虾重量的三分之一以上，每年广东省的虾加工下脚料就达数十万吨。而随着我国海产业及人工养殖虾、蟹业的发展，这些废弃物数量将越来越大，造成了严重的环境污染(Ferraroetal.,2010,Valorisationofnaturalextractsfrommarinesourcefocusedonmarineby-products:Areview)。另一方面，它们又是一类宝贵的生物资源，废弃虾壳中含有丰富的生物资源，如几丁质、蛋白质、虾青素等，具有很高的开发利用价值(ShahidiandSynowiecki,1991)。因此，如何实现对废弃虾壳的综合利用，回收其中的活性成分已经成为了研发的热点。尽管几丁质酶可以有效地水解几丁质，但大多数几丁质酶不能直接水解虾壳，其中顽强的高度有序的几丁质蛋白质结构是它们接近几丁质的主要障碍。完整的几丁质生物质表皮形成不可渗透的包膜，以防止其自身被酶降解。Chit46在虾壳经过蛋白酶预处理和脱蛋白后可以有效地水解回收虾壳几丁质，但却几乎不水解完整的虾壳。来自柯达喀尔热球菌的Tk-ChiA可以降解虾壳，但最大还原糖产量仅为3.12％(ChenL.,etal.AnArchaealChitinaseWithaSecondaryCapacityforCatalyzingCelluloseandItsBiotechnologicalApplicationsinShellandStrawDegradation,FrontiersinMicrobiology,10.doi:10.3389/fmicb.2019.01253)，维罗纳气单胞菌的重组ChiB565(ZhangY.,etal.High-yieldproductionofachitinasefromAeromonasveroniiB565asapotentialfeedsupplementforwarm-wateraquaculture,ApplMicrobiolBiotechnol(2014)98:1651-1662.DOI10.1007/s00253-013-5023-6)和Chitinibactersp.GC72的几丁质酶(GaoC.,etal.CharacterizationofextracellularchitinasefromChitinibactersp.GC72anditsapplicationinGlcNAcproductionfromcrayfishshellenzymaticdegradation,BiochemicalEngineeringJournal,97(2015)59-64.https://doi.org/10.1016/j.bej.2015.02.010)报道可以直接水解虾壳，但他们几丁质酶的产量却很低。因此，开发更高效的几丁质酶是一种最有希望、最经济、最节能的绿色战略，增强几丁质酶对虾壳的底物亲和力是实现这一目标的最可行方法之一。目前为止，尚未见有人将融合碳水化合物结合模块的几丁质酶用于虾壳直接水解。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶。本专利技术的又一目的在于提供上述融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的制备方法。本专利技术的又一目的在于提供上述融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶，包括将带有连接肽的碳水化合物结合模块与几丁质酶Chit46的C端串联构成的融合几丁质酶。所述的几丁质酶Chit46为中国专利申请CN201910064040.5所记载的几丁质酶Chit46。所述的碳水化合物结合模块优选包括枯草芽孢杆菌糖苷酶的碳水化合物结合模块(CBM)。来自动物，植物和细菌的大多数几丁质酶在距其催化结构域一段距离的N或C末端具有一个或多个碳水化合物结合模块(CBM)，而来自真菌的许多几丁质酶则没有CBM。本专利技术人意外发现，添加CBM可以提高几丁质酶对虾壳底物的亲和力。CBM可分为三种类型：A型，可识别有序结晶多糖的表面；B型，结合在多聚糖链的内部(内切型)；C型，结合多聚糖链的末端(外切型)。这些CBM可以直接结合底物，并引起糖苷酶的多重攻击或持续性攻击，从而确保长时间的接触并显著增加多糖表面的有效浓度以增强其活性。此外，一些CBM可以破坏结晶多糖的结构，导致底物结合位点增加。所述的枯草芽孢杆菌糖苷酶的碳水化合物结合模块(CBM)优选为枯草芽孢杆菌168菌株的碳水化合物结合模块(CBM)；更优选为枯草芽孢杆菌168菌株的碳水化合物结合模块中的CBM3、CBM6和CBM26中的至少一种；所述的CBM3的氨基酸序列来源于序列Genbank：CAA82317；所述的CBM6的氨基酸序列来源于序列Genbank：CAB13699；所述的CBM26的氨基酸序列来源于序列Genbank：CAA23437。所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的氨基酸序列优选如SEQIDNO.1～3所示的任一氨基酸序列。编码所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的核苷酸序列优选如SEQIDNO.4～6所示的任一核苷酸序列。一种重组载体，含有上述融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的核苷酸序列。一种重组基因工程菌株，含有上述重组载体；是将上述重组载体转入基因工程菌株获得。一种利用基因工程技术生产融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的制备方法，包括如下步骤：(1)获得包含上述融合碳水化合物结合模块的几丁质酶编码基因的重组载体；(2)将步骤(1)获得的重组载体转入基因工程菌株中，得到重组表达菌株；发酵培养重组表达菌株，收集发酵液；(3)分离步骤(2)收集的发酵液，取上清得到粗酶液，即得融合碳水化合物结合模块的几丁质酶酶液。步骤(2)中所述的基因工程菌株选自细菌、酵母和真菌；优选为酵母；更优选为毕赤酵母GS115。步骤(2)中所述的发酵培养的培养基优选为BMMY液体培养基；所述的发酵培养基(总体积1000mL)优选由以下成分组成：酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB13.4g，甲醇15mL，1M磷酸钾(pH6.0)100mL。步骤(3)中所述的纯化优选通过镍柱亲和层析和SephadexG-75柱层析纯化。所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶在虾壳废弃物的新型绿色回收工艺和/或食品中的应用。所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶可以以粗酶液的形式也可以将粗酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶，其特征在于，包括将带有连接肽的碳水化合物结合模块与几丁质酶Chit46的C端串联构成的融合几丁质酶。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合碳水化合物结合模块的几丁质酶，其特征在于，包括将带有连接肽的碳水化合物结合模块与几丁质酶Chit46的C端串联构成的融合几丁质酶。


2.根据权利要求1所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶，其特征在于，所述的几丁质酶Chit46为中国专利申请CN201910064040.5所记载的几丁质酶Chit46；
所述的碳水化合物结合模块包括枯草芽孢杆菌糖苷酶的碳水化合物结合模块；
所述的枯草芽孢杆菌糖苷酶的碳水化合物结合模块为枯草芽孢杆菌168菌株的碳水化合物结合模块；进一步为枯草芽孢杆菌168菌株的碳水化合物结合模块中的CBM3、CBM6和CBM26中的至少一种；
所述的CBM3的氨基酸序列来源于序列Genbank：CAA82317；
所述的CBM6的氨基酸序列来源于序列Genbank：CAB13699；
所述的CBM26的氨基酸序列来源于序列Genbank：CAA23437。


3.根据权利要求1所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶，其特征在于，所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1～3所示的任一氨基酸序列；
编码所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的核苷酸序列如SEQIDNO.4～6所示的任一核苷酸序列。


4.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求3所述的融合碳水化合物结合模块的几丁质酶的核苷酸序列。


5.一种重组基因工程菌株，其特征在于，含有权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗晓春，李宗球，邓俊劲，陆德林，李志伟，史丹，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44