一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶及其表达基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种耐高糖的β‑葡萄糖苷酶及其表达基因和应用，该酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术首次克隆并重组表达了微生物微泡菌ALW1耐高糖β‑葡萄糖苷酶的基因。该酶具有好的葡萄糖、半乳糖、木糖耐受性，而且是一种在常温范围内保持较好活性的中温低酸性酶。

【技术实现步骤摘要】
一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶及其表达基因和应用
本专利技术涉及酶工程
，具体涉及一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶及其表达基因和应用。
技术介绍
随着科学技术的发展，能源消耗加快。木质纤维素生物质作为生产乙醇和化学品的可再生资源引起了广泛关注，然而，木质纤维素生物量的顽固性是木质纤维素转化成本高的主要原因。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系统的一个组成部分，这是一个水解纤维素β-1,4键的复合酶，它具有三类酶的组成部分：(1)内切葡聚糖酶(酶代码EC3.2.1.4)，其作用于纤维素链上，催化内键的随机断裂，从而生成葡萄糖和纤维低聚糖；(2)从多糖还原端和非还原端释放纤维二糖的纤维二糖水解酶(酶代码EC3.2.1.91)和(3)从纤维低聚糖释放葡萄糖的β-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶，代码EC3.2.1.21)。由于内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性通常都受到纤维二糖和短纤维低聚糖的抑制，可见β-葡萄糖苷酶易被葡萄糖等纤维素糖化产物抑制。因此，寻找具有高糖耐量的新型β-葡萄糖苷酶已成为研究热点。然而，相关技术中的β-葡萄糖苷酶的耐糖谱小，通常仅耐葡萄糖。本专利技术提出了一种耐糖量高且耐糖谱广的β-葡萄糖苷酶。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。其中，该酶包括472个氨基酸，无信号肽序列；其具有好的葡萄糖、半乳糖、木糖耐受性，而且是一种在常温范围内保持较好活性的中温低酸性酶；其最适pH为4.5，在4.0-6.0的范围内维持1h左右的酶活性约65％，最适温度为40℃，在25-45℃仍具有50％以上的相对酶活力。当以pNPG为底物时，葡萄糖、D-(+)-半乳糖和D-(+)-木糖可促进该酶的活性。在800mM葡萄糖中，该酶的相对活性达到175％，在1000mMD-(+)-木糖中达到127％，在600mMD-(+)-半乳糖中达到123％。在本专利技术的第二方面，本专利技术提出了一种编码上述的耐高糖的β-葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。基因包含一个开放的1419个碱基对，编码472个氨基酸残基的蛋白质。在本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种含有上述β-葡萄糖苷酶基因的重组载体。在本专利技术的第四方面，本专利技术提出了一种由上述重组载体转化宿主得到的重组工程菌。其中，所述宿主体为大肠杆菌细胞。在本专利技术的第五方面，本专利技术提出了一种制备耐高糖的β-葡萄糖苷酶的方法，其包括构建含上述的β-葡萄糖苷酶基因的重组载体；将所述重组载体转化至宿主体内，以便获得重组工程菌；将所述重组工程菌进行诱导培养，从培养液中获得耐高糖的β-葡萄糖苷酶。在本专利技术的第六方面，本专利技术提出了上述的β-葡萄糖苷酶在纤维素降解中的应用。本专利技术首次克隆并重组表达了微生物微泡菌ALW1耐高糖β-葡萄糖苷酶的基因。该酶可减少葡萄糖和纤维二糖在纤维素糖化过程中产生的抑制作用，从而降低木质纤维素生物质生产乙醇和化学品等生物燃料的生产成本。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为根据本专利技术实施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A的SDS-PAGE分析；图2为根据本专利技术实施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A的最适pH；图3为根据本专利技术实施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A的pH稳定性；图4为根据本专利技术实施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A的最适温度；图5为根据本专利技术实施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A的热稳定性；图6为根据本专利技术实施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A的不同糖耐受性；图7为根据本专利技术实施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A的不同浓度糖耐受性；图8为根据本专利技术实施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A对纤维二糖降解率的影响；图9为根据本专利技术实施例的β-葡萄糖苷酶MGlu1A为1.42U时纤维二糖的降解速率。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的技术方案。应理解，本专利技术提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本专利技术可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更
技术实现思路
的情况下，当亦视为本专利技术可实施的范畴。为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本专利技术的示例性实施例。虽然显示了本专利技术的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。本专利技术的试验材料和试剂包括：1、菌株及载体海洋细菌Microbulbifersp.ALW1(JCM33586，CICC23821)、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)、pET-28a(+)质粒，实验室保存。2、酶类及其它生化试剂DNA纯化回收试剂盒、基因组DNA提取试剂盒购于东盛生物技术有限公司，引物由博瑞生物技术有限公司(厦门，中国)合成，质粒小提取试剂盒购于天根生化科技有限公司，2×EasyTaqPCRSuperMix购于北京全式金生物技术有限公司，蛋白Marker、核酸电泳Marker、限制性内切酶SalI、EcoRI、dNTPMixture、TaKaRaTaqTM、T4DNALigase和PrimerHSDNAPolymerase购于TaKaRa公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素和高效感受态细胞制备试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司，Nisepharose6FastFlow购于GEHealthcareLifeSciences公司。其它都为国产分析纯试剂均可从普通生化试剂公司购买得到。3、培养基微泡菌ALW1种子培养基：海带粉5g/L、K2HPO42g/L,MgSO4·7H2O1g/L,NaCl30g/L,FeSO4·7H2O0.01g/L。大肠杆菌(LB)肉汤培养基：胰蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl10g，用去离子水溶解并定容至1000mL,121℃灭菌20min后备用。下面参考具体实施例，对本专利技术进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本专利技术。实施例1β-葡萄糖苷酶MGlu1A基因的克隆与表达Microbulbifersp.ALW1在25℃的种子培养基中培养12h，获得了微泡菌ALW1(JCM33586，CICC23821)的基因组DNA，并用组织DNA试剂盒提取了微泡菌ALW1的基因组D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种耐高糖的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种编码如权利要求1所述的耐高糖的β-葡萄糖苷酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种含有权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶基因的重组载体。


4.一种由权利要求3所述的重组载体转化宿主得到的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱艳冰，焦晓佳，李清彪，倪辉，姜泽东，李志朋，陈艳红，杨远帆，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35