一株异源表达纤维素酶基因EGⅤ的毕赤酵母工程菌株及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种异源表达纤维素酶基因EGⅤ的毕赤酵母工程菌及其应用，所述的工程菌为Pichia pastoris‑eg5，其于2019年8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18422。通过PCR方法从里氏木霉获得葡萄糖内切酶基因(EGⅤ)，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，获得pPIC9K‑eg5表达载体。通过电转化将载体导入到毕赤酵母GS115中获得重组毕赤酵母菌株，用不同浓度的抗生素G418筛选含有高拷贝整合质粒的重组酵母菌株。并通过摇瓶发酵初步优化确定了最佳诱导条件，同时对纯化后的重组蛋白酶酶学性质分析。

【技术实现步骤摘要】
一株异源表达纤维素酶基因EGⅤ的毕赤酵母工程菌株及应用
本专利技术属于纤维素酶基因工程
,尤其涉及异源表达纤维素酶基因EGⅤ的毕赤酵母菌株的构建及应用。
技术介绍
木质纤维素是一种丰富的可再生资源，其可以转化为多种生物能源和化学产品。将木质纤维素转化为燃料乙醇的研究正受到越来越多的关注。但是木质纤维素转化生产燃料乙醇过程中，酶制剂成本及酶解过程约占其生产成本的40％，所以降低纤维素酶生产成本或通过统合生物加工过程(Consolidatedbioprocessing，CBP)整合酶解和发酵过程是提高木质纤维素乙醇生产经济性的重要手段。纤维素酶是由多种酶系组成的复合酶系统，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。市场上大多数商业纤维素酶是由木霉菌和曲霉分泌的，如里氏木霉、康氏木霉与黑曲霉等。其中里氏木霉抗代谢抑制能力强，生产的纤维素酶具有较高的酶活性，已成为工业上应用最广泛的纤维素酶生产菌株。然而，里氏木霉的酶系中存在多种蛋白质，导致纤维素酶所占的比例不高，并且各纤维素酶的比例主要由其自身调控，很难进行人工控制。通过在酵母中表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅤ蛋白的构建方法，包括以下步骤：/n(1)里氏木霉RNA和cDNA的获得：培养里氏木霉QM9414，直至出绿色孢子，然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；/n(2)目的基因的克隆：设计合理引物，合适的条件，PCR扩增出EGⅤ的基因；/n(3)构建表达载体：以Ppic9k质粒为载体，将EGⅤ基因插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoR Ⅰ，3'端酶切位点为Not Ⅰ，构建Ppic9k-EGⅤ表达载体；/n(4)获取重组菌株：以bgl Ⅰ为Ppic9k-EG Ⅴ表达载体的线性化位点。实现表达...

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅤ蛋白的构建方法，包括以下步骤：
(1)里氏木霉RNA和cDNA的获得：培养里氏木霉QM9414，直至出绿色孢子，然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；
(2)目的基因的克隆：设计合理引物，合适的条件，PCR扩增出EGⅤ的基因；
(3)构建表达载体：以Ppic9k质粒为载体，将EGⅤ基因插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoRⅠ，3'端酶切位点为NotⅠ，构建Ppic9k-EGⅤ表达载体；
(4)获取重组菌株：以bglⅠ为Ppic9k-EGⅤ表达载体的线性化位点。实现表达载体线性化，然后通过电转化转入毕赤酵母，得到EGⅤ的重组酵母；
(5)重组菌株的筛选：利用含不同浓度的抗生素G418的YPD平板筛选含有高拷贝整合质粒的重组酵母菌株；
(6)诱导表达条件的优化：将菌株P.pastoris-eg2-3接至BMMY(含0.5％甲醇)中诱导，29℃，280rpm，振荡培养。24h、48h、72h、96h、120、144、168取样，每次取样都会补充一定量的甲醇，通过测定酶活和蛋白含量以确定最佳的诱导时间；将重组菌株接至BMMY(含0.5％甲醇)中进行不同温度(24、26、28、30℃)诱导，280rpm，振荡培养，在最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导温度；将重组菌株接至含0.5％甲醇的发酵培养基BMMY中进行不同转速诱导，在最佳温度培养，最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导转速；
(7)重组菌株的诱导产酶：将筛选后的菌株，摇瓶发酵，加入适当甲醇诱导产酶；
(8)重组蛋白活性检测：刚果红-CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶；
SDS-PAGE检测重组蛋白是否为目的蛋白及其蛋白表达量；
(9)酶学性质分析：通过硫酸铵沉淀、镍柱纯化得到电泳纯水平的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文超，王新光，沈钰清，贾士儒，钟成，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12