一株异源表达纤维素酶基因EGⅤ的毕赤酵母工程菌株及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种异源表达纤维素酶基因EGⅤ的毕赤酵母工程菌及其应用，所述的工程菌为Pichia pastoris‑eg5，其于2019年8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18422。通过PCR方法从里氏木霉获得葡萄糖内切酶基因(EGⅤ)，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，获得pPIC9K‑eg5表达载体。通过电转化将载体导入到毕赤酵母GS115中获得重组毕赤酵母菌株，用不同浓度的抗生素G418筛选含有高拷贝整合质粒的重组酵母菌株。并通过摇瓶发酵初步优化确定了最佳诱导条件，同时对纯化后的重组蛋白酶酶学性质分析。

【技术实现步骤摘要】
一株异源表达纤维素酶基因EGⅤ的毕赤酵母工程菌株及应用
本专利技术属于纤维素酶基因工程
,尤其涉及异源表达纤维素酶基因EGⅤ的毕赤酵母菌株的构建及应用。
技术介绍
木质纤维素是一种丰富的可再生资源，其可以转化为多种生物能源和化学产品。将木质纤维素转化为燃料乙醇的研究正受到越来越多的关注。但是木质纤维素转化生产燃料乙醇过程中，酶制剂成本及酶解过程约占其生产成本的40％，所以降低纤维素酶生产成本或通过统合生物加工过程(Consolidatedbioprocessing，CBP)整合酶解和发酵过程是提高木质纤维素乙醇生产经济性的重要手段。纤维素酶是由多种酶系组成的复合酶系统，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。市场上大多数商业纤维素酶是由木霉菌和曲霉分泌的，如里氏木霉、康氏木霉与黑曲霉等。其中里氏木霉抗代谢抑制能力强，生产的纤维素酶具有较高的酶活性，已成为工业上应用最广泛的纤维素酶生产菌株。然而，里氏木霉的酶系中存在多种蛋白质，导致纤维素酶所占的比例不高，并且各纤维素酶的比例主要由其自身调控，很难进行人工控制。通过在酵母中表达外源基因生产纤维素酶不仅能够使酵母具备直接降解纤维素的能力，而且可以通过人工手段来调控酶的合成与分泌，有利于对纤维素酶的酶学性质和相互作用进行研究，从而进一步提高其酶活能力。目前，重组蛋白表达系统主要有：大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、转基因植物或动物表达系统和体外翻译系统。其中，真核生物具有生长快、培养容易、遗传操作简单，同时还可以对表达蛋白进行加工、修饰和折叠等特点，因此真核生物的表达系统越来越受到重视和广泛应用。其中巴斯德毕赤酵母表达系统是最近发展起来的较为完善的、应用最广泛的甲醇营养型酵母表达系统。重组毕赤酵母菌株外源基因表达能力强，稳定性高，可以胞外分泌纤维素酶蛋白，并且自身分泌的蛋白成分极少有利于表达蛋白的分离纯化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组表达EGⅤ酶的毕赤酵母工程菌，即利用基因工程的技术手段，将里氏木霉的纤维素内切葡聚糖酶EGⅤ基因转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株。该菌株能高效表达纤维素内切葡聚糖酶EGⅤ，为了提高重组菌株的产酶量，研究了摇瓶培养的诱导时间、温度、转速。并且对分离纯化后的蛋白酶进行了酶学性质分析。最终将菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。本专利技术所采用的技术方案是：(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得：将里氏木霉QM9414培养出绿色孢子，接种于诱导培养基获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；(2)目的基因的克隆：设计合理引物，PCR扩增出目的基因；(3)构建表达载体：以Ppic9k质粒为载体，将EGⅤ基因插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoRⅠ，3'端酶切位点为NotⅠ，构建Ppic9k-EGⅤ表达载体；(4)获得重组菌株：以里氏木霉cDNA为模板，通过PCR成功扩增出目的片段，经双酶切法成功构建了重组质粒pPIC9K-EGⅤ；通过电转将重组质粒转入毕赤酵母，通过MD平板、MM平板、YPD平板(含不同浓度浓度的G418)、基因组PCR获得重组菌株；(5)重组菌株的筛选：利用含不同浓度的抗生素G418的YPD平板筛选含有高拷贝整合质粒的重组酵母菌株；(6)诱导表达条件的优化：将菌株P.pastoris-eg4-4接至BMMY(含0.5％甲醇)中诱导，29℃，280rpm，振荡培养。24h、48h、72h、96h、120、144、168取样，每次取样都会补充一定量的甲醇，通过测定酶活和蛋白含量以确定最佳的诱导时间；将重组菌株接至BMMY(含0.5％甲醇)中进行不同温度(24、26、28、30)℃诱导，280rpm，振荡培养，在最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导温度；将重组菌株接至含0.5％甲醇的发酵培养基BMMY中进行不同转速诱导，在最佳温度培养，最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导转速；(7)重组蛋白活性检测：利用SDS-PAGE检测分泌的蛋白是否有目的蛋白以及刚果红-CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶(8)酶学性质分析：通过硫酸铵沉淀、镍柱纯化得到电泳纯水平的重组酶，在不同pH条件下测酶活，确定最适pH；在最适pH，在不同温度条件下测定重组酶酶活，确定最适温度；在重组酶的最适pH和最适温度下，取不同浓度的底物CMC，测得相应的反应速度V，得到重组酶的动力学常数。(9)酶学性质分析：通过硫酸铵沉淀、镍柱纯化得到电泳纯水平的重组酶，在不同pH条件下测酶活，确定最适pH；在最适pH，在不同温度条件下测定重组酶酶活，确定最适温度；在重组酶的最适pH和最适温度下，取不同浓度的底物CMC，测得相应的反应速度V，得到重组酶的动力学常数。(10)菌株保藏：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年8月26日；酵母工程菌株编号：CGMCCNo.18422；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。本专利技术的优点：1.本专利技术将与组氨酸(His)对应的6个密码子导入基因的引物中，使目的蛋白带有His标签，有利于镍柱对其进行纯化。2.本专利技术诱导表达毕赤酵母重组菌株时，对诱导表达条件进行了优化，并添加适量甲醇，使诱导效果最佳，提高了重组菌株的产酶效率。3.本专利技术对重组酶的基本酶学性质进行了测定，发现重组酶的基本酶学性质与天然里氏木霉分泌酶的酶学性质相似，可代替里氏木霉天然分泌核心酶组分用于纤维素基质水解中。4.本专利技术实现了纤维素酶蛋白EGⅤ在毕赤酵母中的异源表达，提高了重组毕赤酵母菌在甲醇诱导发酵过程中的产酶效率，提升重组毕赤酵母菌的工业生产潜力。附图说明图1是EGⅤ的PCR扩增图；图2是Ppic9k-EGⅤ的菌落PCR验证图；图3是Ppic9k-EGⅤ表达质粒图谱；图4是线性化核酸电泳图EGⅤ；图5是EGⅤ重组毕赤酵母的基因组PCR图；图6是刚果红-CMC验证诱导酶是否活性EGⅤ；图7是EGⅤ菌株发酵液上清的SDS-PAGE图；图8是PCR扩增EGⅤ的测序对比图。具体实施方式实施案例1目的基因的克隆1.将保存于甘油管的里氏木霉QM9414孢子悬液，从-80℃冰箱中取出置于冰(或4℃冰箱)中解冻，至孢子悬液完全融化。将孢子悬液振荡混合均匀，接种环沾取少量菌液，在PDA培养基平板上划线接种。用封口膜将平板封口后，正置于28℃培养箱中培养。培养约5-7天，至培养基表面上布满绿色孢子。将平板从培养箱中取出，置于4℃冰箱中备用。2.将新鲜孢子接种于纤维素酶固体诱导培养，表面铺上灭菌的玻璃纸，静置培养，直到菌丝长出来。从玻璃纸上刮下菌丝，用液氮冷冻研本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅤ蛋白的构建方法，包括以下步骤：/n(1)里氏木霉RNA和cDNA的获得：培养里氏木霉QM9414，直至出绿色孢子，然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；/n(2)目的基因的克隆：设计合理引物，合适的条件，PCR扩增出EGⅤ的基因；/n(3)构建表达载体：以Ppic9k质粒为载体，将EGⅤ基因插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoR Ⅰ，3'端酶切位点为Not Ⅰ，构建Ppic9k-EGⅤ表达载体；/n(4)获取重组菌株：以bgl Ⅰ为Ppic9k-EG Ⅴ表达载体的线性化位点。实现表达载体线性化，然后通过电转化转入毕赤酵母，得到EGⅤ的重组酵母；/n(5)重组菌株的筛选：利用含不同浓度的抗生素G418的YPD平板筛选含有高拷贝整合质粒的重组酵母菌株；/n(6)诱导表达条件的优化：将菌株P.pastoris-eg2-3接至BMMY(含0.5％甲醇)中诱导，29℃，280rpm，振荡培养。24h、48h、72h、96h、120、144、168取样，每次取样都会补充一定量的甲醇，通过测定酶活和蛋白含量以确定最佳的诱导时间；将重组菌株接至BMMY(含0.5％甲醇)中进行不同温度(24、26、28、30℃)诱导，280rpm，振荡培养，在最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导温度；将重组菌株接至含0.5％甲醇的发酵培养基BMMY中进行不同转速诱导，在最佳温度培养，最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导转速；/n(7)重组菌株的诱导产酶：将筛选后的菌株，摇瓶发酵，加入适当甲醇诱导产酶；/n(8)重组蛋白活性检测：刚果红-CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶；/nSDS-PAGE检测重组蛋白是否为目的蛋白及其蛋白表达量；/n(9)酶学性质分析：通过硫酸铵沉淀、镍柱纯化得到电泳纯水平的重组酶，在不同pH条件下测酶活，确定最适pH；在最适pH，不同温度条件下测定重组酶酶活，确定最适温度；在重组酶的最适pH和最适温度下，取不同浓度的底物CMC，测得相应的反应速度V，得到重组酶的动力学常数；/n(10)菌株的保藏：表达纤维素酶基因EGⅤ的毕赤酵母工程菌株的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年8月26日；酵母工程菌株编号：CGMCCNo.18422；毕赤酵母工程菌株的分类命名为：巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。/n...

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅤ蛋白的构建方法，包括以下步骤：
(1)里氏木霉RNA和cDNA的获得：培养里氏木霉QM9414，直至出绿色孢子，然后接种于固体诱导培养基(表面贴有玻璃纸)获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；
(2)目的基因的克隆：设计合理引物，合适的条件，PCR扩增出EGⅤ的基因；
(3)构建表达载体：以Ppic9k质粒为载体，将EGⅤ基因插入启动子AOX1下游，5'端酶切位点为EcoRⅠ，3'端酶切位点为NotⅠ，构建Ppic9k-EGⅤ表达载体；
(4)获取重组菌株：以bglⅠ为Ppic9k-EGⅤ表达载体的线性化位点。实现表达载体线性化，然后通过电转化转入毕赤酵母，得到EGⅤ的重组酵母；
(5)重组菌株的筛选：利用含不同浓度的抗生素G418的YPD平板筛选含有高拷贝整合质粒的重组酵母菌株；
(6)诱导表达条件的优化：将菌株P.pastoris-eg2-3接至BMMY(含0.5％甲醇)中诱导，29℃，280rpm，振荡培养。24h、48h、72h、96h、120、144、168取样，每次取样都会补充一定量的甲醇，通过测定酶活和蛋白含量以确定最佳的诱导时间；将重组菌株接至BMMY(含0.5％甲醇)中进行不同温度(24、26、28、30℃)诱导，280rpm，振荡培养，在最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导温度；将重组菌株接至含0.5％甲醇的发酵培养基BMMY中进行不同转速诱导，在最佳温度培养，最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导转速；
(7)重组菌株的诱导产酶：将筛选后的菌株，摇瓶发酵，加入适当甲醇诱导产酶；
(8)重组蛋白活性检测：刚果红-CMC方法检测重组毕赤酵母是否分泌有活性的纤维素降解酶；
SDS-PAGE检测重组蛋白是否为目的蛋白及其蛋白表达量；
(9)酶学性质分析：通过硫酸铵沉淀、镍柱纯化得到电泳纯水平的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文超，王新光，沈钰清，贾士儒，钟成，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12